谢 斌，李万万

(上海交通大学 材料科学与工程学院，上海 200240)

基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)作为一种有力的分析手段，在许多生物分子分析中广泛应用，如多肽分析、蛋白质分析、核酸分析等[1]。作为一种软电离质谱技术，MALDI-MS通过基质吸收激光的能量并将其传递给待测分子从而使其离子化，这种技术有诸多优点，如样品制备简单，灵敏度高，可检测分子范围广(最高可达300 kDa)等[2]。然而，由于作为基质的有机分子在激光的作用下会产生大量的无规律碎片，MALDI-MS很难应用于分子量小于500的待测物的分析[3-4]。为了解决这个问题，很多无机粒子(如硅[5-6]、碳[7]、金属[8-9]、金属氧化物[10]等)被作为基质用于MALDI-MS的小分子分析。这些粒子在小分子分析的过程中产生的背景信号很小，有效地拓宽了MALDI-MS的应用范围。

在MALDI-MS的小分子分析中，作为基质的材料必须满足：(1)在特定激光(通常为355 nm)作用下稳定；(2)能够将激光的能量传递给目标分子。贵金属粒子(如金、银、铂等)在激光作用下能产生独特的表面等离子共振和热载流子[11-12]，是基质的理想材料。尽管目前已有很多研究报道了贵金属粒子作为基质在MALDI-MS中的应用[13-15]，但主要是针对粒子自身的不同形貌进行研究。有研究表明，贵金属纳米壳层相比于单纯的贵金属纳米粒子，具备一定的表面粗糙度，有利于捕获待测分子，更适合用于MALDI-MS的小分子检测[16-17]。如Gan等设计了一种二氧化硅/金(SiO2@Au)复合的纳米核壳结构材料应用于MALDI-MS，实现了复杂溶液中多种小分子的检测[16]；Huang等将二氧化硅/银(SiO2@Ag)复合纳米小球作为基质，成功检测出了血清中的微量葡萄糖[17]。

本研究采用聚多巴胺修饰还原法制备了一种核壳结构的聚苯乙烯-马来酸酐共聚物/银(PSMA@Ag)复合材料，由银纳米粒子包覆在微米尺寸的聚苯乙烯-马来酸酐共聚物微球表面，形成复合微球，并探究了其作为基质在MALDI-MS中的应用。着重考察了PSMA@Ag微球在MALDI-MS中对小分子待测物的分析效果，并以脯氨酸和丝氨酸为目标物，证实了该材料对于使用MALDI分析小分子的可行性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

聚苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA，MW=17 000)、丝氨酸、脯氨酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、葡萄糖、盐酸多巴胺、十二烷基硫酸钠(SDS)(美国Aldrich公司)；硝酸银、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH 8.5)、三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)(上海麦克林生化科技有限公司)；氢氧化钠、氨水(上海国药集团化学试剂有限公司)。

SPG膜乳化装置(日本SPG membrane / SPG Technology有限公司)；冷冻干燥机；Nicolet 6700红外光谱仪、JEOL JSM-7800F Prime扫描电子显微镜(美国Thermo Scientific公司)；UV-2550紫外-可见光谱仪(日本Shimadzu公司)；Autoflex speed质谱仪(德国Bruker公司)采用Nd:YAG激光，波长为355 nm。

1.2 材料制备与表征

聚苯乙烯-马来酸酐共聚物微球由膜乳化-乳液溶剂挥发法(MESE法)制备得到[18]。将200 mL 0.5%(质量分数)的 SDS水溶液作为连续相，8 mL含7%聚苯乙烯-马来酸酐共聚物的甲苯溶液作为分散相，分别加入膜乳化装置中。膜乳化装置采用孔径大小为4.9 μm的多孔玻璃膜(SPG膜)。对分散相施加5 kPa的氮气压力使其通过SPG膜进入连续相，待分散相中的液体耗尽时停止反应。为使甲苯挥发，在室温下对所得的乳液持续匀速搅拌24 h，随后分别用去离子水和无水乙醇对乳液各进行3次离心洗涤，将得到的聚苯乙烯-马来酸酐共聚物微球冷冻干燥备用。

为了在微球表面修饰银纳米粒子，需先在其表面包覆一层聚多巴胺薄膜[19]。将100 mg聚苯乙烯-马来酸酐共聚物微球分散在pH 8.5的Tris缓冲液中，加入100 mg盐酸多巴胺，室温搅拌3 h，用去离子水离心洗涤3次后使其分散在25 mL水中。向其中加入20 mL质量浓度为10 mg/mL的葡萄糖溶液和0.8 mL浓度为2 mol/L的氢氧化钠溶液。最后，向混合物中加入25 mL新鲜配制的质量浓度为20 mg/mL的银氨溶液，剧烈搅拌30 min，得到的PSMA@Ag复合微球用去离子水充分清洗3次后冷冻干燥备用。

1.3 MALDI-MS分析

取制备的微球5 mg，分散于10 mL去离子水中，形成0.5 mg/mL 的基质悬浊液。使用传统基质CHCA作为对照，并将其用乙腈-水-三氟乙酸(50∶50∶0.001，体积比)溶解，质量浓度为4 mg/mL。将待测物配制成0.4～400 pmol/μL的标准溶液。

MALDI-MS分析时，取0.5 μL待测物溶液和0.5 μL基质悬浊液充分混合，将混合物滴在样品板上，待溶剂在室温下挥发后上机分析。数据分析中，仅将信噪比(SNR)大于10的峰视为有效峰，其对应的待测物浓度视为本次实验的检出限(LOD)。

1.4 稳定性测试

将5组0.5 mg/mL 的PSMA@Ag复合微球基质悬浊液分别在4、25、37、60、80 ℃下放置24 h，记录其用于分析400 pmol/μL脯氨酸的峰强度(m/z=222)，每组实验重复3次。

图1 未经修饰的PSMA微球和经过PDA包覆后 的PSMA微球的FT-IR谱图Fig.1 FT-IR spectra of bare and PDA coated PSMA microbeads

将0.5 mg/mL 的PSMA@Ag复合微球基质悬浊液室温保存，在第0、7、30、60、82 d时分别用其分析400 pmol/μL脯氨酸，并记录峰强度用其分析400 pmol/μL脯氨酸，并记录峰强度(m/z=222)，每组实验重复3次。

图2 PSMA 微球和PSMA@Ag 复合微球的SEM照片Fig.2 SEM images of PSMA and PSMA@Ag microbeads A.PSMA microbeads;B.PSMA@Ag microbeads; C.localized surface of PSMA@Ag microbead

图3 PSMA 微球和PSMA@Ag 复合微球的 紫外-可见光吸收光谱Fig.3 UV-Vis spectra of PSMA and PSMA@Ag microbeads

2 结果与讨论

2.1 材料的表征

在修饰银纳米壳层之前，首先要在材料的表面包覆上一层聚多巴胺(PDA)薄膜。这是因为银粒子对氨基有着很强的亲和力[20]，而PDA薄膜能够为材料的表面提供大量的氨基[19,21]。图1为PSMA微球在包覆PDA前后的FT-IR图谱，其中1 743 cm-1为来自酸酐的振动，2 923 cm-1和2 850 cm-1处归属于亚甲基和甲基，而3 027、1 601、 1 493、1 453、 757、698 cm-1为来自苯环的振动。经PDA包覆之后，PSMA@Ag的图谱在PSMA的基础上增加了1 293 cm-1处的峰，为来自苯环上C—OH的伸缩振动，证明PDA成功包覆。

图2是所得材料的扫描电镜图。由图2A可知，所制备的PSMA为规则的球体，且粒径均一，平均直径在5.7 μm 左右。经过聚多巴胺的包覆和银氨离子在微球表面的还原反应后，得到了如图2B所示的PSMA@Ag复合微球：银纳米粒子均匀地分布在微球的表面，无局部团聚情况出现。图2C展示了PSMA@Ag复合微球的部分表面，银纳米粒子的粒径处于50 ～ 80 nm 之间。对比两种微球的紫外可见光谱(图3)发现，PSMA@Ag 复合微球在442 nm 处出现了明显的吸收峰，证明了银的存在。

2.2 MALDI-MS分析氨基酸

分别选择脯氨酸(非极性，Mw=115)和丝氨酸(极性，Mw=105)作为待分析分子，研究了PSMA@Ag复合微球作为基质用于MALDI-MS小分子分析的可行性。对于非极性的氨基酸脯氨酸(200 pmol)，使用传统基质CHCA进行检测时，产生了非常大的背景信号(图4A)，导致结果无法分析。相比之下，使用PSMA@Ag复合微球对相同物质的量的脯氨酸进行分析，能够得到清晰完整的质谱图(图4B)，其中[M+107Ag]+和 [M+109Ag]+的信号SNR均达到了1 000以上，二者强度相似是因为银元素的两种同位素在自然界中的丰度相近。在待测物离子化的过程中，复合微球表面的银纳米粒子吸收激光能量并将其转移给待测分子，而基底高分子可使银纳米粒子形成壳状的结构，进而使得纳米粒子间因此而产生缝隙，有利于待测分子直接吸附在微球表面[17]，从一定程度上起到了富集的作用。为了进一步研究PSMA@Ag复合微球对脯氨酸的检出限，逐级降低待测物含量，在脯氨酸含量仅为2 pmol 时，使用PSMA@Ag复合微球作为基质仍能清晰地观察到待测物的信号峰(SNR=17,图4C)。类似地，对于极性氨基酸丝氨酸，使用传统基质CHCA检测仍然会在分析过程中产生大量背景噪声(图4D)，而采用PSMA@Ag复合微球基质能够得到清晰完整的质谱图(图4E)。值得注意的是，在丝氨酸电离过程中产生的[M+109Ag]+和[107Ag2]+两种粒子的质荷比都在214左右，体现在质谱图上即出现了两个相近的尖峰，这从另一个角度反映了该方法的精确性。实验发现，丝氨酸的含量仅为1 pmol时，仍能观察到明显的待测物信号(SNR=41)(图4F)。说明PSMA@Ag复合微球在MALDI小分子分析中有望发挥巨大的作用。

表1列举了其他纳米材料作为MALDI基质用于分子量小于500的待测物分析的一些成果。可以看出，目前大部分研究报道的纳米材料作为基质分析小分子的工作中，检出限多停留在10 pmol左右，PSMA@Ag复合微球所实现的检测灵敏度相比之下略有提高。值得关注的是，考虑到本文在数据分析过程中，只将SNR大于10的峰视为有效峰，其对应的待测物浓度视为本次实验的检出限，而同类文献设置的有效峰SNR水平为3或没有相关描述，因此，PSMA@Ag复合微球相比于其他材料作为基质，具备其自身的优越性。

表1 其他纳米材料作为MALDI基质用于小分子检测的一些成果Table 1 Recent publications about nanomaterials serving as MALDI matrix for small molecular detection

2.3 PSMA@Ag复合微球基质分析小分子的稳定性

在实际应用过程中，PSMA@Ag复合微球需要有足够的稳定性。为了考察不同条件下PSMA@Ag复合微球的检测性能，将其在不同温度下保存24 h后，对脯氨酸进行检测。从图5A中可以看出，在4～60 ℃下，PSMA@Ag复合微球的检测性能几乎不受影响，而当微球在80 ℃处理24 h后，目标物的峰强度明显下降，这可能是高温导致材料的结构发生改变所致。为了探究PSMA@Ag复合微球的长期稳定性，在制备完成后经过不同时间分别对同一浓度的脯氨酸进行了分析,结果如图5B所示，PSMA@Ag复合微球能够在室温保存的条件下于82 d 内保持对脯氨酸的测试稳定性。

3 结 论

采用简单的聚多巴胺包覆还原法制备了均一、稳定的PSMA@Ag复合微球，该微球可在MALDI-MS分析中作为无机基质，用于分子量较小(低于500)的目标物分析，且所得谱图简单，无碎片基质分子，谱峰强度高，检测灵敏度好，相比于传统有机基质具有优越性，在MALDI-MS小分子分析中有着广阔的应用前景。