戴利铭，刘一贤，施玉萍，李岚岚，张 璇，蔡志英*

（1.云南省热带作物科学研究所，云南景洪666100；2.西双版纳职业技术学院，云南景洪666100）

橡胶树种植主要分布在海南、广东、广西、福建、云南等地区，温暖湿润的气候非常适宜多种病原微生物的生存繁衍，导致橡胶树病害种类繁多。目前国内已知危害橡胶树的病害多达90 多种，其中叶部病害的病原菌主要有橡胶粉孢属（Oidium spp.）［1］、炭疽菌属（Colletotrichum spp.）［2］、棒孢属（Corynespora spp.）［3］等。云南省热带作物科学研究所植物保护和微生物利用中心2015 年在广东、海南橡胶苗圃病害调查中发现1 种新的橡胶树叶部病害，症状表现：叶片感病后，最初出现黄色小斑点，随后病斑逐渐扩展成直径5～15 mm 的近圆形至不规则形的灰褐色至灰色病斑。经形态学观察和ITS 序列分析，鉴定该病原菌为嘴突凸脐蠕孢（Exserohilum rostratu），为我国橡胶树叶片的一种新病害［4］。

蠕形分生孢子真菌是禾本科植物上的常见病原菌，主要包括平脐蠕孢属（Bipolaria spp.）、弯孢属（Curvularia spp.）、凸脐蠕孢属（Exserohilum spp.）、内脐蠕孢属（Drechslera spp.）等，据报道该类致病菌引起香蕉叶斑病［5］、牛筋草叶斑病［6］、桂牧叶斑病［7］、玉米叶斑病［8］等。作为蠕形分生孢子真菌之一的嘴突凸脐蠕孢在国内研究报道的并不多，从不同寄主植物上分离到的嘴突凸脐蠕孢因生长环境的不同而存在生物学上的某些差异。本研究以橡胶树新叶斑病上分离得的嘴突凸脐蠕孢菌作为研究对象，采用十字交叉法进行生物学特性基础数据库的研究，现将结果报道于下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试病原菌

本研究室前期分离、保存、鉴定的病原菌种［4］。

1.1.2 供试药剂

木糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、淀粉、果糖、半乳糖、甘油、色氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、精氨酸、尿素、蛋白胨、硫酸铵、胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸均为国产分析纯，购自昆明拓源公司。

1.1.3 仪器

超净工作台（苏州净化SW-CJ-2FD）、恒温培养箱（天津泰斯特DH5000B Ⅱ）、水浴锅（德国HAAHE HAAKEDC100）、分析天平（梅特勒托利多PL203）

1.1.4 培养基

（1）PDA 培养基：土豆200 g，葡萄糖15 g，琼脂18 g，水定容至1 000 mL，自然pH；（2）查氏琼脂培养基（Czapek）：硝酸钠2 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂15～20 g，水定容至1 000 mL。上述培养基均在121℃高压灭菌20 min 后备用。

1.2 方法

1.2.1 温度对病菌生长的影响

病原菌在PDA 培养基上培养5 d 后用直径为5 mm 的灭菌打孔器打取菌块，将菌丝块面向下接种于备用PDA 培养基中，分别测定在5、10、15、20、25、28、30、35℃等不同温度条件下菌丝生长量（恒温培养箱中黑暗培养），每个处理重复3次，培养5 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，参考番华彩方法［7］。

1.2.2 pH 对菌丝生长的影响

将制成的菌块接种于不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的PDA 培养基上，测定不同条件下菌丝生长情况，方法同1.2.1。

1.2.3 病原菌菌丝的致死温度

将制成的菌块置于放有2 mL 无菌水的玻璃试管中，于40、45、50、51、52、53、54、55、60℃等不同温度条件下恒温水浴锅处理10 min，分别取不同温度处理的菌饼接种于PDA 平板中央，观察菌落生长情况，以一支在室温中放置的试管作为对照，方法同1.2.1。

1.2.4 碳源对菌丝生长的影响

以不含蔗糖的Czapek 培养基作为基础培养基，加入等量木糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、淀粉、果糖、半乳糖、甘油10 种碳源，制成不同碳源培养基，以Czapek 培养基为对照，测定不同碳源对菌丝生长的影响，方法同1.2.1。

1.2.5 氮源对菌丝生长的影响

以色氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、精氨酸、尿素、蛋白胨、硫酸铵、胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸11 种氮源代替Czapek 培养基中的硝酸钠，配制不同氮源培养基，测定氮源对菌丝生长的影响，方法同1.2.1。

1.2.6 光照对病原菌生长的影响

设24 h 黑暗、24 h 光照、12 h 黑暗/12 h 光照共3 种光照条件，将病原菌分别置于不同光照条件下培养，测定光对菌丝生长的影响，方法同1.2.1。

1.3 统计分析

采用Excel 2003 进行数据分析和多重比较。

2 结果

2.1 温度对病原菌生长的影响

对病原菌菌丝体生长特性测定结果表明（图1），在10～40℃病原菌都能生长，适宜生长的温度范围为25～30℃，培养5 d 后菌落直径在70～74 mm，最适温度为30℃，菌落直径达74.08 mm。病原菌菌丝在超过35℃时对温度比较敏感；低于5℃时菌丝体无法正常生长。

2.2 pH 对病原菌生长的影响

从图2 中可知，在pH 3～9 的范围内，病原菌菌丝生长存在差异。pH 6～9 时，菌丝生长较快，菌落直径范围64.60～73.5 mm；当pH 值小于4，菌丝虽能正常生长，但生长很缓慢；pH7、pH8 很适合菌丝生长，菌落直径达70.8 mm 和73.5 mm。

2.3 病原菌菌丝的致死温度

以室温下的处理作为对照，设置了9 个温度处理，病原菌在40、45、50、51、52℃处理10 min 后仍然能在PDA 平板上正常生长；53℃及以上温度处理10 min 后未生长（表1）。由此表明，病原菌的致死温度为53℃，10 min。

表1 菌丝致死温度测定

2.4 碳源对病原菌生长的影响

病原菌在供试的10 种碳源上均可生长，但对不同碳源利用程度存在差异（图3）：对淀粉利用率最高，菌丝生长速度最快，培养5 d 后菌落直径达71.13 mm；在半乳糖、木糖、麦芽糖、乳糖、山梨醇、甘露醇的查氏培养基上生长状况良好；而在含有甘油的查氏培养基上生长受到抑制，菌落直径为54.5 mm。

2.5 氮源对病原菌生长的影响

试验结果（图4）表明，在含有11 种不同氮源的查氏培养基上，该菌生长状况存在较大差异：在含有牛肉浸膏和酵母浸膏的查氏培养基上生长最快，菌落直径显著大于其他氮源培养基上的菌落直径，且病原菌生长旺盛；而在含有丙氨酸、胱氨酸和硫酸铵的查氏培养基上生长最慢；而对精氨酸、尿素、蛋白胨、甘氨酸、酪氨酸则利用效果一般。

2.6 光照条件对病原菌生长的影响

光照处理5 d 后，发现24 h 光照和12 h 黑暗/12 h 光照两种条件下菌丝的菌落生长速率基本一致，菌落直径在76.1～77.6 mm；完全黑暗条件下生长稍慢（图5）。

3 结论

云南省热带作物科学研究所从广东、海南多个苗圃橡胶叶斑病材料上分离得到的致病菌，经形态和分子生物学鉴定为嘴突凸脐蠕孢（Exserohilum rostratum），首次报道了嘴突凸脐蠕孢能侵染橡胶叶片引起叶斑病。对该病菌的生物学特性研究表明，该病原菌最适生长温度为25～30℃，当温度低于10℃或高于35℃，菌丝生长受限，这与张弛成［8］在中国热带农业科学院牧草种植资源圃进行病害调查中发现的嘴突凸脐蠕孢引起的桂牧叶斑病上分离得到的病原菌相似，其最适生长的温度在25～32℃，最适生长温度28℃。此外，本项研究的该菌生长最适pH 7～9，与张弛成报道的桂牧叶斑病菌研究结果相接近（pH 为6.5），但研究发现光照对菌丝生长无显著影响，这与张弛成和林善海［5］报道的桂牧叶斑病和香蕉叶斑病研究结果不同，这或许是由于地域分布不同而造成种间的差异。

研究表明，该菌能利用多种碳源、氮源，其中以蔗糖、木糖、麦芽糖、乳糖、淀粉为碳源生长较好，对氮源的利用效率以牛肉浸膏和酵母浸膏为优，丙氨酸和硫酸铵为氮源时严重抑制病原菌生长。张弛成［8］研究报道的该菌在含麦芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖的培养基上生长较好，对氮源的利用效率以硝酸钠为优，牛肉浸膏利用较为一般，尿素为氮源时严重抑制病原菌生长。可以看出，源自不同寄主的嘴突凸脐蠕孢对碳源和氮源的利用是有差异的。席兴文等［9］提出，同属不同种的菌对碳源、氮源的利用及培养特征可作为分类鉴定的依据。而针对橡胶树嘴突凸脐蠕孢对某些碳源、氮源利用效率较低的特点，可以尝试创新新的防治措施。

据报道，嘴突凸脐蠕孢作为植物致病菌危害马唐草［10］、台湾青枣［11］、香牛筋草［12］等。对于防治，张弛成［8］对桂牧叶斑病分离得到的病原菌进行室内毒力测定，发现对嘴突凸脐蠕孢毒力最强的杀菌剂为咪鲜胺和苯醚甲环唑，EC50分别为0.0071 mg/L 和0.0072 mg/L。由于不同寄主来源的嘴突凸脐蠕孢叶斑病菌株间的生物学特性存在差异，故对有效防治橡胶树嘴突凸脐蠕孢叶斑病的药剂还需进一步研究。