兰天艳，张永娥，郭鹏辉，郭小腊，陈轶霞，王明明，郑亚东

多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis)的幼虫寄生于动物或人的肝脏和肺脏，可引起多房棘球蚴病，又称泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)。AE主要流行于北半球高纬度地区及冻土地带，遍及北美洲[1]、欧洲[2]和亚洲[3]。在我国，AE主要流行于北部、西北部和西南部的农牧区[3-5]。截止2016年8月，全球报道的AE患者有1 076例(占棘球蚴病的5.78%)，而我国2012-2016年报道的有1 008例(占棘球蚴病的19.64%)[6-8]。虽然，AE患者数量明显少于由细粒棘球蚴引起的囊型棘球蚴病(cystic echinococcosis, CE)患者的数量，但由于AE潜伏期长，且常被误诊为肝癌或肝硬化，同时术后一年病死率显著高于CE(CE病死率为0.70%，AE病死率为2.27%)[6]，因此AE对人体危害更为严重，故又被称为“虫癌”[9]。

在棘球绦虫生活史中，需要两种不同的哺乳动物参与其中。临床上发现，在不同的中间宿主中存在两种类型的包囊，即一种是具有大量原头蚴的可育包囊，其原头蚴附着于生发层或游离于囊液中，另一种则是没有或仅有少量原头蚴的不育包囊。目前，对于包囊不育的研究尚处于初步阶段，其分子机制仍未知。前期研究发现，在细粒棘球绦虫的不育囊中，含有一定水平的宿主IgG，生发层和原头蚴的基因组DNA出现严重损伤，大量细胞出现凋亡[10-11]，推测基因组损伤或/和细胞凋亡最终引起包囊不育。我们前期研究发现，与寄生在肝脏的包囊相比，多房棘球蚴在皮下寄生时包囊内原头蚴的数量明显减少，个别原头蚴发育异常，腔内富含糖原的不规则的小泡明显减少，提示皮下寄生不利于虫体发育，可引起包囊不育[12]。因此，我们以皮下寄生的多房棘球蚴为实验材料，探究早期不育包囊的蛋白组学特征，为深入研究棘球绦虫包囊不育的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1小鼠 BALB/c小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，均为雄性，约4周龄。

1.2多房棘球蚴 在实验室，多房棘球蚴腹腔接种于长爪沙鼠(Meriones unguicutatus)，进行连续传代保种。在无菌条件下，分离多房棘球蚴包囊，之后将包囊置铜网上研磨。利用自然沉降法，将研磨出的原头蚴在预冷的PBS中自然沉降5次，每次10 min。取少量原头蚴，用台盼蓝染色，在显微镜下计数，并观察原头蚴的活力。

1.3主要试剂 过渡性内质网ATP酶(transitional endoplasmic reticulum ATPase, VCP)、烯醇化酶(Enolase)由本实验室制备的兔源多克隆抗体，14-3-3的抗体由本实验室制备的鼠源单克隆抗体，β-Actin的抗体购自Abcam 公司，谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase, GST)的抗体购自Sigma公司。HRP标记的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG均购自Seracare公司。牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制剂、台盼蓝、Schiff试剂购自Sigma公司。4×蛋白上样缓冲液(含巯基还原剂)购自索莱宝公司。ECL化学发光显色液购自Invitrogen公司。苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自碧云天公司。预染蛋白Marker购自赛默飞公司。

1.4虫体皮下接种及蛋白质的制备 每只小鼠皮下多点注射约600只原头蚴，并尽可能去除宿主组织。用PBS洗两次后，再用滤纸吸干包囊表面残留的液体并称重。在液氮中研磨虫体，之后按每20 mg 25 mL的量加入含有1%蛋白酶抑制剂的PBS，4 ℃轻摇过夜。将混合液于4 ℃ 12 000 g离心10 min，收集上清。利用Bradford的方法测定蛋白质的浓度后，送蛋白质样品至华大基因进行测序。

1.5测序分析 通过SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后分别获取胶片上不同位置的蛋白质胶条，酶解后再抽提出肽段，再最后运用LC-MS/MS质谱技术测定对应肽段的质谱图。利用Mascot2.3.02软件，结合多房棘球蚴蛋白质数据库(https://www.genedb.org/)，鉴定所有虫体蛋白质。最后，对所有鉴定的蛋白质进行功能和信号通路注释，即Gene Ontology (http://www.geneontology.org/)和COG分析。

1.6Western blotting分析 将上述1.4中制备的虫体粗抗原(约80 μg)与4×蛋白质上样缓冲液充分混合，煮沸8～10 min，之后利用12%的SDS-PAGE胶进行蛋白质电泳，条件如下：90 V恒压条件下电泳30 min，之后转换成120 V恒压电泳60 min。在转膜时，先将PVDF膜用无水乙醇浸泡3 min，再用蒸馏水洗涤数次。利用Bio-Rad转膜仪进行转膜，30 V恒压，电转1 h。将PVDF膜浸泡在2% BSA(用PBST配制)的PBS中，室温封闭90 min。用PBST洗涤数次后，将膜与一抗(各种抗体均以1∶1000倍稀释)4℃孵育过夜。次日，用PBST洗涤3次后，将膜与HRP标记的二抗(均以1∶10 000倍稀释)室温孵育1 h，之后用PBST洗涤3次，每次10 min。曝光时，先加ECL化学发光显色液，再与PVDF膜避光孵育2 min，最后利用X光胶片在暗室曝光。

1.7组织切片染色 将新鲜分离的包囊固定在4%的多聚甲醛溶液中，48 h后制备切片。按照如下方法进行HE染色：首先利用二甲苯脱蜡，再将切片从高浓度到低浓度的乙醇中浸泡。用蒸馏水冲洗2 min后，苏木素染色5～10 min。将染了色的切片浸在自来水中，冲洗去多余的染色液，约10 min。蒸馏水洗涤数次后，置切片于5%的乙酸溶液中分化2 s，自来水冲洗10 min，再用伊红染色30 s。用低浓度到高浓度的乙醇脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片。

1.8糖原染色 首先利用二甲苯脱蜡，再将切片从高浓度到低浓度的乙醇浸泡。用蒸馏水冲洗2 min后，将切片放在高碘酸溶液中浸泡3 min。用自来水冲洗3 min后，Schiff试剂浸泡约15 min。用蒸馏水冲洗2 min后，苏木素染色3 min。将染了色的切片浸在自来水中，冲洗去多余的染色液，约10 min。用低浓度到高浓度的乙醇中脱水，二甲苯透明，封片。

2 结 果

2.1小鼠感染及皮下寄生包囊的形态结构观察 剖检结果发现，在感染的15只小鼠中，8只为阳性，皮下均有一个或两个明显包囊，包囊如绿豆大小，呈微透明状(图1，箭头所示)。在光学显微镜下，可见包囊中含有子囊，囊中仅有少数原头蚴，且一些原头蚴头节上还带有小钩(图2，箭头所示)；囊壁糖原染色阳性，呈粉红色(图2)。

图1 多房棘球蚴在皮下寄生一个月时形成的包囊Fig.1 A subcutaneous cyst one month post infection of Echinococcus multilocularis

图2 皮下寄生多房棘球蚴包囊的显微镜观察Fig.2 Microscopic observation of subcutaneous hydatid cyst of Echinococcus multilocularis

2.2测序结果 测序共得到谱图39 698张，通过鉴定，匹配的谱图数量为1 019张，共鉴定522个肽段，对应203种蛋白质，其中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的相对丰度最高，其次为柠檬酸合酶(表1)。在丰度较高的前20种蛋白质中，大部分为酶类，有11种，主要参与糖代谢过程(表1)。在这11种蛋白质中，有7种参与糖代谢，其中有3种蛋白质参与糖酵解过程，分别为烯醇化酶、果糖16二磷酸醛缩酶和磷酸葡萄糖异构酶，有2种参与糖原异生，分别为磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和磷酸葡萄糖异构酶。而参与细胞过程和应激过程的蛋白质各有一种，分别为细丝蛋白和热休克70 kDa蛋白4。

表1 丰度较高的前20种蛋白质
Tab.1 Top 20 proteins abundant identified in hydatid cyst ofEchinococcusmultilocularis

蛋白质蛋白大小/kDa独特肽数独特谱图数序列号代谢过程磷酸烯醇丙酮酸羧激酶71 2261EmuJ_000292700.1柠檬酸合酶 511756EmuJ_001028500.1烯醇化酶 471126EmuJ_000514200.1胞质苹果酸脱氢酶 371017EmuJ_000417100.1果糖16二磷酸醛缩酶 40924EmuJ_000905600.1ATP合酶亚基β线粒体56 915EmuJ_000752000.1鸟氨酸氨基转移酶 46 8 9EmuJ_001032200.1转酮醇酶68 815EmuJ_000103100.1谷氨酸脱氢酶58711EmuJ_000589100.1磷酸葡萄糖异构酶62714EmuJ_000626300.1热休克蛋白6061715EmuJ_001190900.1苹果酸脱氢酶36614EmuJ_001185000.1细胞过程细丝蛋白25710EmuJ_000859700.1刺激应答过程热休克70 kDa蛋白47169EmuJ_001085400.1其他过程推测的主要穹窿蛋白971724EmuJ_000142500.1NADP结合域蛋白4178EmuJ_000511900.1乙酰辅酶A水解酶转移酶55710EmuJ_001087900.1基底膜特异性硫酸乙酰肝素8666EmuJ_000575900.1吞蛋白B12959EmuJ_000550800.1凝溶胶蛋白4257EmuJ_000882300.1

2.3蛋白质功能注释 在分子功能方面，所鉴定的203种蛋白质中有107种蛋白质具有催化活性，如转酮醇酶、烯醇化酶等，有101种蛋白质具有结合活性，而具有蛋白质/核酸结合转录因子活性、电子载体活性及分子转导活性等方面的蛋白质则非常少。在生物学过程方面，包括细胞过程、代谢过程和单组织过程，分别有94、93和84种(图3)，而参与免疫过程的蛋白质则很少，仅有4种，分别为泛素核糖体蛋白L40、组蛋白H4样(Priapulus caudatus)、细丝蛋白和26S蛋白酶调节亚基7。在细胞组成方面，参与组成细胞器、细胞的蛋白质占绝大多数(260/462)，而参与组成胶原蛋白三聚体、突触的蛋白则非常少。COG分析结果表明，参与翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣分子信号通路的蛋白质最为富集，有29种之多(图4)，例如蛋白酶体亚基α型7、蛋白质二硫键异构酶、热休克蛋白家族成员3等。参与能量合成与转换的蛋白质的丰度次之，分别有20种，而参与细胞移动、原噬菌体和转座子的蛋白质仅1种，即肌联蛋白(图4)。

图3 皮下寄生多房棘球蚴蛋白的GO功能注释图Fig.3 GO function annotation of subcutaneous parasitic Echinococcus multilocularis proteins

图4 皮下寄生多房棘球蚴蛋白的COG注释柱图Fig.4 COG annotation of subcutaneous parasitic Echinococcus multilocularis proteins

2.4Western blotting鉴定 为了验证蛋白质测序结果，选取VCP、Enolase、14-3-3、GST和β-actin等5种蛋白质进行Western blotting。结果显示，VCP、Enolase、14-3-3、β-actin在皮下包囊中均有不同程度的表达，但GST并不表达或表达水平非常低(图5)。这与测序结果一致。

A：皮下寄生多房棘球蚴5种蛋白的Western blotting分析；M：分子量标记图5 皮下寄生多房棘球蚴总蛋白的SDS-PAGE Fig.5 (A) SDS-PAGE analysis; (B) Western blotting analysis

3 讨 论

在临床上，细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)和多房棘球绦虫均可形成不育包囊[13-14]。通常情况下，细粒棘球绦虫感染羊时，会形成可育包囊，而在感染牛时则发育为不育包囊，并且不同地区的包囊发育状况存在差异。对多房棘球绦虫来说，通常感染人时会发育为不育包囊。本研究结果表明，在皮下寄生不利于多房棘球蚴发育，几乎所有的包囊没有或仅有少数原头蚴，有向不育囊发育的趋势。这与以前的研究结果相似[12]。

14-3-3蛋白是一种广泛存在于真核生物中的多功能蛋白，参与调节信号转导、凋亡、代谢等重要的生理活动，被认为是细胞分化和增殖过程中的关键分子。在多房棘球蚴，14-3-3蛋白的表达量是其成虫表达量的10倍以上[15]。已经证明，多房棘球绦虫14-3-3蛋白可诱导产生免疫保护，使小鼠免受原发性肺泡包虫病[16]。在我们的实验中，发现14-3-3在皮下寄生包囊中的表达量相对较高，推测它可能在虫体寄生、发育等过程起着重要作用。GST是一种普遍存在的多功能蛋白超家族，也是一种重要的解毒酶，参与细胞清除外源性和内源性毒性物质[17]。在蠕虫寄生过程中，宿主免疫反应可产生一些毒性物质以杀灭寄生虫。值得注意的是，在我们的结果中未检测到GST表达。这表明皮下寄生的多房棘球蚴的抗氧化能力可能有所下降。有研究表明，Caspase-3和RAD9基因在细粒棘球绦虫的不育包囊中表达量明显上升[11，18]，诱导的细胞凋亡大于其自身的修复能力，这可能是由于包囊中不表达或低水平表达GST等一些抗氧化分子，最终导致包囊不育。

在本研究中，我们发现与免疫相关的蛋白质的种类很少，丰度也很低，这可能是由于皮下血管分布较少，使得到达感染部位的免疫细胞及相关免疫分子相对有限，引起的宿主抗虫体的免疫应答较弱所致。同样，这似乎也可以解释为什么磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、柠檬酸合酶、烯醇化酶等参与糖代谢的关键酶种类众多且丰度也较高，这是因为皮下寄生时虫体可获取的营养物质有限，而这些酶可以多种不同的途径合成糖以满足虫体的生长、发育、迁移、繁殖等生命活动[19-21]。

总之，本研究利用LC-MS / MS方法确定了皮下寄生1个月的包囊的蛋白质组成，发现磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、胞质苹果酸脱氢酶、果糖16二磷酸醛缩酶等多种酶的表达水平较高；所鉴定的蛋白质在功能上主要富集在翻译后修饰、蛋白质转换和伴侣分子信号通路、能量合成与转换以及碳水化合物运输与代谢方面，而参与免疫应答、脂质运输与代谢等方面的蛋白质则较少。这些研究结果为深入研究棘球蚴包囊不育的机理提供了有价值的线索。

利益冲突：无