梅明珠，杨先锋，龙 腾，张 琼，赵 静，田 钦，彭娇娇，罗 均，姜 贺，林颖仪，林志雄，郭霄峰

狂犬病(Rabies)是一种动物源性病毒疾病，由狂犬病病毒引起，感染家畜和野生动物，通过接触感染性的材料传播给人，通常是唾液、咬伤或者抓伤。最近也有报道指出母亲在分娩时可将病毒传播给婴儿[1]。狂犬病存在于除南极洲外的所有大陆上的150个国家和地区，每年大约有60 000人死于狂犬病，其中95%的死亡发生在非洲和亚洲。我国也是狂犬病流行最严重的国家之一，发病率仅次于印度，居世界第2位。根据中国卫健委最新统计2018年我国发病人数为422例，死亡人数为410例，目前尚无可靠有效的治疗方法，主要依赖疫苗的免疫接种进行预防。

狂犬病病毒作为单股负链RNA病毒，其基因顺序高度保守即3′-N-P-M-G-L-5′，基因转录mRNA的转录数量取决于其在基因顺序中的位置，离3′端启动子的距离越远，转录效率越低即leader RNA>N>P>M>G>L[2]。通过基因顺序的重排能够改变病毒的基因表达，从而改变病毒的表型。单股负链RNA病毒目中的另一个典型病毒水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)，严格遵守这种转录模式，Wertz等通过重排VSV的基因顺序，能够改变病毒表型，获得低致病性高免疫原性的病毒毒株[3-5]。

狂犬病病毒HEP-Flury(high-egg-passage Flury)，作为一种高减毒狂犬病病毒固定株，已在日本作为狂犬病疫苗株[6]，其转录具有自己的独特模式。前期，我们已对其N和P基因进行了重排，并对基因重排株的表型变化进行了分析[7-8]。在本研究中，我们将对M基因重排株的致病性和免疫原性进行评估，从而找出更适合的狂犬病疫苗候选株。

1 材料与方法

1.1病毒和实验动物 狂犬病病毒亲本株rHEP-Flury、M基因位于基因顺序2位的病毒M2(N-M-P-G-L)、M基因位于基因顺序4位的病毒M4(N-P-G-M-L)由华南农业大学兽医学院郭霄峰课题组通过反向遗传操作系统拯救获得[9]。

孕17～18 d的SPF级雌性昆明系小白鼠、6～8周龄的SPF级雌性昆明系成鼠均购自南方医科大学实验动物中心，许可证号SCXk (粤)2011-0015，其狂犬病病毒血清抗体检测均为阴性，健康状况良好，在华南农业大学实验动物中心SPF条件下进行饲养管理和试验。所有实验程序均遵守NIH条例，并获得华南农业大学动物福利委员会支持。

1.2乳鼠上的毒力试验 由于狂犬病病毒HEP-Flury只对乳鼠有致死性而对成鼠没有，因此选取1～3日龄的乳鼠来进行病毒的毒力测定[10]。首先将病毒rHEP-Flury、M2和M4的滴度都调整为1.0×105.5FFU/ mL，然后再进行10-1～10-6的10倍倍比稀释。每种病毒取10-1～10-5这5个稀释倍数，颅内接种1～3日龄的SPF级昆明系乳鼠，每只乳鼠接种20 μL，每种病毒接种12只乳鼠，同时设置RPMI 1640对照组。接种后每天观察小鼠的状态和死亡数量并记录，持续观察28 d，以Reed-Muench法计算病毒在乳鼠上的半数致死量(LD50)。

1.3活病毒对成鼠的攻毒保护试验 在免疫前对6周龄SPF级昆明系小鼠进行眼角静脉丛采血，收集于高压灭菌的洁净1.5 mL离心管中。然后将离心管置于37 ℃温箱，1 h后再放入4 ℃冰箱过夜。取出离心管于4 ℃离心机3 000 r/min离心10 min，小心将上层血清转入另一个洁净的离心管后放入-80 ℃冰箱待检。此血清既能作为检测抗体时的阴性血清，又能进一步确认所购小鼠是否含有狂犬病病毒抗体。

小鼠采血后24 h，分别将50 μL的rHEP-Flury、M2和M4于后腿腓肠肌免疫接种小鼠，每种病毒接种3个剂量，分别是103FFU、104FFU和105FFU，每个剂量接种10只小鼠。同时以RPMI 1640作为对照。免疫后21 d采集血清，测定抗体，采血后第2 d，用乙醚将小鼠麻醉后颅内注射狂犬病病毒标准攻毒株CVS-24，每只小鼠注射30 μL，包含50个颅内注射LD50(50ICLD50/30 μL)的病毒液，接种后每天观察小鼠的状态和死亡数量并记录，持续观察28 d。

1.4成鼠血清抗体监测 6～8周龄的昆明系小鼠分成4组，每组5只。后腿腓肠肌肌肉接种rHEP-Flury、M2或M4，50 μL/只(105FFU/50 μL)，同时设置RPMI 1640对照组。接种后，每周从小鼠眼角静脉丛采血分离血清，56 ℃ 30 min灭活后利用试剂盒SerelisaRabies Ab Mono Indirect kit (Synbiotics, Lyon, France)进行抗体检测，连续测定10周。

1.5统计分析 利用软件GraphPad Prism 6.0进行作图及统计分析。小鼠血清抗体水平差异显著性分析利用2way ANOVA方法；小鼠存活率利用Kaplan-Meier曲线作图表示，差异显著性分析利用log-rank test 方法。 星号代表统计学差异：*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001；检验水准α=0.05，表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1病毒在乳鼠上的致死性 颅内注射接种乳鼠结果显示：M2在乳鼠上的LD50约是rHEP-Flury的1.5倍，M4的3倍；rHEP-Flury在乳鼠上的LD50约是M4的2倍(图1A)。说明当M基因从病毒基因的2位移至4位时，致死乳鼠的病毒量逐渐降低，揭示病毒毒力随着M基因从2位移至4位逐渐增强。同时我们记录了乳鼠死亡开始的时间，当接种剂量为104.5FFU/mL时，rHEP-Flury、M2和M4引起小鼠死亡开始的时间都是接种后第5 d；当接种剂量为103.5FFU/mL～101.5FFU/mL时，rHEP-Flury和M4引起小鼠死亡开始的时间基本一致，而M2引起小鼠死亡开始的时间推迟，特别是接种剂量为102.5FFU/mL时，推迟更明显(图1B)。说明当M基因从3位移至2位时，病毒引起乳鼠发病时间推迟。这与病毒在NA细胞上的扩散规律一致，因此我们推测病毒在NA细胞上的扩散主要影响了小鼠死亡时间。

A：病毒在乳鼠上的LD50；B：病毒颅内接种后乳鼠死亡开始的时间图1 rHEP-Flury和M基因重排病毒在乳鼠上的致死性Fig.1 Lethality of rHEP-Flury or rearranged viruses for suckling mice

2.2活病毒对成鼠的攻毒保护试验 病毒rHEP-Flury、M2和M4在成鼠上的攻毒保护试验结果显示：当接种剂量为105FFU 和104FFU 时，M2、M4和rHEP-Flury免疫组小鼠的存活率差异没有统计学意义，都显著高于对照组RPMI 1640(图2A、图2B)；当接种剂量为103FFU时，rHEP-Flury免疫组小鼠的存活率明显低于M2和M4免疫组，与对照组RPMI 1640差异没有统计学意义，此时M2和M4免疫组小鼠的存活率仍显著高于对照组RPMI 1640(图2C)。说明随着接种剂量的降低，病毒对小鼠的保护率降低，其中rHEP-Flury组降低最明显，M基因重排组降低不明显。

接种后21 d血清抗体水平检测显示，小鼠血清抗体水平与病毒接种剂量呈正相关。当接种剂量由105FFU变为104FFU时，M2和M4组小鼠的血清抗体水平显著降低；当接种剂量由104FFU变为103FFU时，rHEP-Flury组小鼠的血清抗体水平显著降低(图2D)。与此相符的是，我们发现在攻毒保护试验中，当接种剂量由104FFU变为103FFU时，rHEP-Flury小鼠的存活率明显降低。值得我们注意的是，当接种剂量由105FFU变为103FFU时，病毒M2和M4对小鼠的保护率没有明显降低，但是血清抗体水平显著降低。

A-C: 小鼠存活率曲线；D：小鼠血清抗体水平图2 攻毒保护试验小鼠存活率及血清抗体水平Fig.2 Survial rates and antibody level in the protection of mice

2.3成鼠血清抗体水平 成鼠血清抗体水平监测结果显示，M2、rHEP-Flury和M4免疫组小鼠的血清抗体水平在接种后1～3周快速升高，于第4周达到最高峰，然后快速降低，最后维持在一个高于保护水平0.6 EU/mL的水平(图3)。在此我们推测抗体中和病毒的过程应起始于接种后第3周，主要发生于第4周，因为在接种后第3周至第4周，小鼠抗体水平的增速降低，且在第4周至第5周，小鼠抗体水平的降速最快。此外，我们发现虽然rHEP-Flury免疫组小鼠的血清水平最大值高于M2和M4免疫组小鼠，但是在5周后，M2和M4免疫组小鼠的血清抗体维持水平高于rHEP-Flury免疫组，这可能是因为M2和M4免疫组小鼠血清中有效清除病毒的抗体水平高。

图3 成鼠血清抗体水平的消长规律Fig.3 Antibody kinetics of viruses with M gene translocations

3 讨 论

狂犬病病毒M蛋白主要调节病毒的转录和复制[11-12]，协助G蛋白共同完成病毒粒子的出芽。Ben[13-14]等人研究发现M蛋白能够抑制NF-κB依赖性的基因调节因子的表达，从而抑制细胞免疫反应，使病毒逃避宿主免疫系统的追踪，但是疫苗株没有这种能力[15]。因此，在本研究中，当M基因移至2位时，病毒毒力没有增强。在前期的P基因重排研究中，我们发现P基因位置离启动子位置越远，病毒毒力越弱，不受其他基因位置被动改变影响[7]，因此我们推测病毒M2的毒力降低，主要是因为M基因前移一位时，P基因被动后移一位。对于P基因位置一致的rHEP-Flury和M4，M4的毒力高于rHEP-Flury。病毒M4的M基因在后移一位时，G基因被动前移一位，前期研究表明非致病性狂犬病病毒G蛋白能够诱导人类细胞调亡，从而限制病毒在中枢神经系统中扩散[16]，且HEP-Flury的G蛋白也证实在高MOI情况下能够诱导NA细胞发生凋亡[17-18]，但是我们发现与rHEP-Flury相比，M4的毒力却增强了。因此，我们推测基因重排只是改变了G蛋白的量而没有改变其结构，对病毒在NA细胞中的扩散没有显著影响。在此，HEP-Flury 的M基因可能存在某种机制使得病毒毒力减弱，这还需要进一步研究确认。

狂犬病病毒疫苗株G蛋白能够诱导机体产生中和抗体[19]，N蛋白也能刺激机体Th细胞和中和抗体的产生，诱导机体产生细胞免疫[20]。在本研究中，我们发现当免疫接种剂量为103FFU时，虽然rHEP-Flury和M基因重排株产生的抗体水平差异没有统计学意义，但是其对小鼠的保护率明显低于M基因重排株，因此我们推测M基因重排株产生的有效抗体水平高于亲本株，这在后面的抗体监测分析中可以看出。此外，是否M基因重排后能够诱导更强的细胞免疫从而提高对机体的保护力还有待进一步研究。

综上所述，在狂犬病病毒HEP-Flury的M基因重排研究中，我们发现M基因重排对小鼠的致病性和免疫原性都产生了影响，与亲本株相比，M基因重排株M2具有更低的毒力和更高的保护性，可作为狂犬病疫苗候选株，为狂犬病疫苗的开发提供更好的选择。

利益冲突：无