钟 维,唐天才,刘城成,陈天祥,冯忠勇,郝力力

(1.西南民族大学生命科学与技术学院预防兽医系,四川 成都 610041;2.四川省若尔盖县动物疫病预防与控制中心,四川 若尔盖 624500)

细粒棘球蚴病俗称包虫病,是由细粒棘球绦虫的中绦期幼虫-细粒棘球蚴寄生在人和动物体内所致的一种严重的人兽共患寄生虫病。若尔盖县是全国5大牧区之一,牦牛和藏绵羊是该地区主要的经济动物,也是细粒棘球绦虫主要的中间宿主之一,数量分别达100万和150万余头。当地群众卫生知识匮乏,畜牧业生产管理粗放,为包虫病的发生和流行提供了极为有利的条件。近年来,对若尔盖县牦牛、藏绵羊细粒棘球蚴病的调查鲜有报道,到目前为止,尚不清楚该地区细粒棘球绦虫的流行情况,本试验用COI基因特异性引物对若尔盖县牦牛、藏绵羊细粒棘球蚴感染情况展开了调查,以确定若尔盖县细粒棘球绦虫的虫种。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备和试剂 台式高速离心机(Eppendorf 5402型)、Bio-Rad伯乐梯度 PCR仪(PTC240型)、2×Easy Taq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司);组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司);细粒棘球绦虫G1株基因组DNA由本实验室保存。

1.2 包囊样本的采集 由若尔盖县动物疫控中心负责采集,共采集牦牛和藏绵羊肝、肺组织包囊58份,均来自若尔盖县屠宰场。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 使用天根生化科技(北京)有限公司组织基因组DNA提取试剂盒,按照说明书进行操作。

1.3.2 COI基因PCR检测 包囊样本采用PCR方法进行检测,反应体系、条件和引物参照Bowles所采用的方法[1],COI基因特异性引物序列为：F1：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′,R1： 5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′,阳性产物送华大基因科技服务有限公司测序。

1.3.3 进化树分析 核苷酸序列应用Clustal X 1.81进行比对,分子进化树用MEGA6构建。

2 结果

2.1 牦牛和藏绵羊脏器上的包囊 对58个疑似感染细粒棘球蚴的牦牛、藏绵羊包囊(其中牦牛肝包囊12个,肺包囊26个,藏绵羊肝包囊20个)进行调查分析,由中插彩版图1所示,牦牛包囊均为单个存在,相互之间无通连现象。剖开有大量清澈的包囊液,尤其是肝脏包囊,内有大量子囊。通过镜检,所有牦牛脏器上的包囊内均无原头节,均为不育囊,且牦牛包囊多见于肺脏,肝包囊较少。藏绵羊脏器上的包囊多见于肝脏,包囊数目较多,剖开后囊液清澈,内有大量原头节,如中插彩版图2所示。

2.2 PCR检测

包囊COI基因检测结果：采用Bowles建立的PCR方法进行检测,58头包囊样本共检出32头阳性,如图3所示,在400～500 bp间出现目的条带,目的条带为440 bp,总感染率为55.1%。

图3 部分阳性样本COI基因PCR反应后电泳图

2.3 进化树分析 将32个包囊阳性样本测序后,最终得到6个克隆,6个序列和 G1株(AB491440)的同源性在99.3% ～100%之间,将6个分离株的测定序列和GenBank参考序列进行种系发育关系分析,应用Mega6软件绘制系统发育进化树,如图4所示,分离到的6个COI基因序列全部属于G1株,它们位于一个大的分支上：其中6和G1亲缘关系最近,其次是16和4,8、32、31处于同一分支上,亲缘关系最近,但8和32亲缘关系更近。

图4 6个分离株在基于COI基因构建的细粒棘球绦虫进化树上的分布

3 讨论

若尔盖县只有一个屠宰场,屠宰场屠宰不规范,容易出现脏器随意丢弃的现象,极易使吞食含有包囊脏器的犬感染包虫病。本试验仅对若尔盖县屠宰场的58个疑似感染细粒棘球蚴的牦牛、藏绵羊的肝、肺组织包囊进行PCR了检测,所有包囊阳性率为55.1%(32/58),其中有26个疑似包囊未检出,可能是由肝片吸虫、结核杆菌等病原造成的。由于屠宰场没有对包囊来源的牛、羊屠宰基数进行统计,且早期感染包囊不明显,存在一定的漏检,故屠宰后包囊的疑似感染率是一个未知数,后期还需屠宰场对包囊来源的牛、羊基数进行系统登记以确定包囊的准确检出率。

狐狸、犬、狼等终末宿主吞食中间宿主牦牛、藏绵羊包囊而感染包虫,成虫在小肠内发育成熟排出虫卵,污染草、饲料和饮水,牛羊等中间宿主因吞食虫卵而受感染。本研究对若尔盖县58个疑似感染细粒棘球蚴的牦牛、藏绵羊包囊(其中牦牛肝包囊12个,肺包囊26个,藏绵羊肝包囊20个)进行调查分析得到所有藏绵羊包囊内均有原头节,如果包囊未能被正确销毁,犬吞食后在犬体内发育成成虫,排出虫卵污染环境;有文献报道,大部分牛包囊为不育囊,只有少数包囊内有原头节[2],本试验中所有牦牛包囊内虽无原头节,但该县牦牛基数大,犬通过采食含有细粒棘球蚴的牦牛脏器也极易受到感染。

线粒体DNA中的COI基因可以作为生物条形码对物种进行鉴定[3]。据报道,细粒棘球绦虫有10个不同的种(G1～G10),其中G1株在世界范围内流行最为广泛,也是我国的主要流行株[4]。本研究以细粒棘球绦虫COI基因为靶基因,对若尔盖县58个疑似感染细粒棘球蚴的牦牛、藏绵羊的肝、肺组织包囊进行了PCR检测,最终通过进化分析确定该县动物所感染包虫的虫种为细粒棘球绦虫G1株,为该地区后期包虫病的防控、畜牧业健康发展提供了数据支持。