黄家亮 何浩瑜 黄威祥

摘要：目的  探讨无创产前基因检测技术在产前筛查中的应用价值。方法  选择 2018年1月～2019年8月在我院自愿选择无创产前基因检测的孕妇5000名，采集外周血浆应用高通量测序进行胎儿游离DNA检测，高风险者行胎儿羊水染色体核型分析，并对5000名孕妇妊娠结局进行追踪随访。结果  发现57名孕妇有异常情况，其中21-三体31名，假阳性2名;18-三体5名，假阳性3名;13-三体4名，假阳性3名;性染色体异常17名，假阳性7名。随访显示21-三体假阴性1名。结论  无创产前基因检测技术用于胎儿染色体非整倍体尤其是21-三体的检测具有较高的准确性，但对于其他非整倍体检测的准确性还有待进一步提高。

关键词：无创产前基因检测;染色体;非整倍体;高通量测序技术

Abstract：Objective  To explore the application value of noninvasive prenatal genetic testing technology in prenatal screening.Methods  Choose 5000 pregnant women who voluntarily choose noninvasive prenatal genetic testing in our hospital from January 2018 to August 2019，collect peripheral plasma and use high-throughput sequencing to detect fetal free DNA， and perform karyotype analysis of the fetal amniotic fluid chromosomes in high risk individuals， and follow-up of 5000 pregnant women's pregnancy outcomes.Results 57 pregnant women were found to have abnormalities， including 21-trisomy 31， 2 false positives; 18-trisomy 5， 3 false positives; 13-trisomy 4， 3 false positives; 17 sex chromosome abnormalities ， 7 false positives. Follow-up showed 21-trisomy 1 false negative.Conclusion  The noninvasive prenatal gene detection technology used in the detection of fetal chromosomal aneuploidy， especially 21-trisomy， has high accuracy， but the accuracy of other aneuploidy detection needs to be further improved.

無创产前基因检测技术是通过采集孕妇的外周血，利用二代测序技术对母体血浆中的游离DNA片段（平均长度166 kb）测序，对测序结果进行生物信息学分析，从而获取胎儿的遗传信息，以评估胎儿患染色体非整倍体的风险。2012年9月12日，卫生部发布的《中国出生缺陷防治报告（2012）》指出，我国出生缺陷发生率与世界中等收入国家的平均水平接近，约为5.6%，每年新增出生缺陷数约90万例，染色体非整倍体疾病是胎儿畸形中较为常见的疾病，在胎儿畸形占比中高达1/60，所以对孕妇进行染色体非整倍体产前检查具有十分重要的意义。目前，许多国内医疗机构相继采用了无创产前基因检测技术进行染色体非整倍体方面的检测，认为该技术对染色体非整倍体具有很高的准确性。基于此，本文对无创产前基因检测技术在贵港地区产前筛查的应用情况进行分析，现报道如下。

1对象与方法

1.1研究对象  选择 2018年1月～2019年8月在贵港市妇幼保健院遗传咨询后充分了解无创产前胎儿染色体非整倍体基因检测技术的前提下，签署知情同意书，自愿选择无创产前基因检测的5000名孕妇作为研究对象。孕妇年龄18～43岁，孕周12～24周，≥35岁高龄孕妇1530名（30.60%）。

1.2无创产前基因检测技术  配套专用K管抽取孕妇静脉血5 ml，冷冻离心机4 ℃条件下1600 r/min离心10 min，16000 r/min离心10 min两步法分离血浆，提取血浆中游离DNA，PCR扩增，制备混合文库，制作纳米球，利用联合探针锚定聚合测序法进行测序，对测序数据进行生物信息学分析，参照正常人群数据库计算Z值来评估胎儿患染色体非整倍体的风险。

1.3胎儿羊水染色体核型分析  通过绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺和脐带血穿刺进行染色体核型分析是判断胎儿染色体异常的“金标准”[1]。胎儿羊水染色体核型分析按照 2010年卫生部《胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准第2部分：胎儿染色体异常的细胞遗传学产前诊断技术标准》执行。孕妇术前需排空膀胱，取仰卧位，B超仪实时引导下行羊膜腔穿刺，无菌抽取羊水，分装于2支15 ml管心管置离心机1500 r/min下离心10 min，弃上清液余2～3 ml沉淀，沉淀与两种不同的羊水培养液混匀后分别接种于2个培养瓶，分别置于2个温度为37 ℃，CO2浓度5%的培养箱中7 d，倒置显微镜观察细胞生长情况，镜下可见多于5个克隆细胞时换液，使用无菌细胞刮刮下克隆，混匀继续培养，每天观察细胞生长情况，当羊水细胞贴壁生长旺盛，加20 μg/ml秋水仙素3 h后收获细胞，温度28 ℃，湿度70%环境下制片，G显带后使用蔡司全自动扫描系统进行染色体核型分析。

1.4观察指标  对无创产前基因检测结果为-3

2结果

选择无创产前基因检测的5000名孕妇中57名筛查为高风险，阳性率1.14%。21-三体31例（0.62%），18-三体5例（0.10%），13-三体4例（0.08%），性染色体非整倍体异常17例（0.34%）。其中55名选择了羊水产前诊断（产前诊断率96.49%），确诊21-三体28例，18-三体2例，13-三体1例。2例未行产前诊断的孕妇随访均为性染色体非整倍体阴性，随访中发现1例21-三体假阴性。无创产前基因检测方法的21-三体的检出率为96.55%（28/29），阳性预测值90.32%（28/31），假阳性率0.06%（3/4971）;18-三体的检出率100.00%（2/2），阳性预测值40.00%（2/5），假阳性率0.06%（3/4998）;13-三体的检出率100.00%（1/1），阳性预测值25.00%（1/4），假阳性率0.06%（3/4999）;性染色体非整倍体的检出率100.00%（8/8），阳性预测值53.33%（8/15），假阳性率0.18%（9/4992）。

3讨论

染色体异常（包括数目异常和结构异常）是引起出生缺陷的主要原因，临床上常见的染色体疾病有唐氏综合征（21-三体）、爱德华综合征（18-三体）、帕陶氏综合征（13-三体）、特纳综合征（45，X）、克氏综合征（47，XXY），大约占产前诊断疾病的80%[2]。这类染色体疾病主要表现为智力低下、生长发育迟缓、或合并有其他脏器多种畸形，患有这类病症的儿童无疑给家庭和社会带来了巨大的负担。

目前染色体病并没有根治的方法，唯一有效的措施为采取产前筛查和诊断的方式来减少患病胎儿的出生。对于染色体疾病的筛查，目前我国普遍使用的两联、三联唐氏血清学产前筛查，以及联合B超的综合筛查，检出率只有60%～80%，假阳性率高达5%。研究发现[3]，产前筛查高风险人群染色体异常发生率仅为2.14%，说明大多数的孕妇可能会被过度产前诊断。不同的唐氏筛查组合仍有5%～50%的漏诊率，漏诊多发生在唐氏筛查临界风险的孕妇中，郑文吉等[4]研究发现，宁波市2012～2014年156498例孕妇中唐氏综合症假阴性14例，其中临界风险占10例。Lewis C等[5]研究发现，20.1%的唐氏筛查为临界风险的孕妇感到焦虑，其希望获得安全、准确的进一步检查。临床上对胎儿染色体疾病的产前诊断主要是绒毛膜穿刺、羊水穿刺和脐带血穿刺的介入性产前诊断，但介入性产前诊断技术具有一定的操作危险性，可能导致胎儿宫内感染以及流产等不良后果，其中流产率高达1%[6]，同时也给孕妇造成极大的心理负担。介入性诊断技术还需进行细胞培养，TAT较长。因此，寻求安全、快速、准确的产前诊断技术是优生优育的要求。随着2016年我国二胎政策的全面放开，大量的高龄孕妇均需产前诊断，现有的卫生资源将无法满足日益增加的产前诊断需要。

近年来，随着居民生活水平的提高和优生优育意识的加强，无创产前基因检测技术得以高速发展。Lo YM等[7]研究证实在孕妇的血浆中存在有胎儿游离 DNA 片段，为无创产前基因检测技术提供了依据。无创产前基因检测通过对母体血浆中游离胎儿DNA进行高通量测序，可将唐氏综合征、爱德华综合征、帕陶氏综合征的检出率分别提升至99%、96%、91%，假阳性率从5%降至0.35%[8]。孕妇本人及家属顾忌有创的产前诊断方法对胎儿和孕妇的影响，使得无创产前基因检测技术成为多数孕妇的选择。虽然无创产前基因检测被认为是一种精准的产前检测技术，对于21-三体、18-三体、13-三体及性染色体非整倍体具有较高的准确性，可减少大量不必要的有创性产前诊断，但同时无创产前基因检测技术存在着检测假阳性和假阴性的问题，所以并不能取代介入性产前诊断。如何降低其假阳性、避免假阴性已经成为临床亟待解決的问题。本次研究发现，57例高风险孕妇中有16例胎儿羊水染色体核型分析结果正常，也说明了无创产前基因检测技术存在假阳性问题。引起假阳性的主要原因有限制性胎盘嵌合、母体染色体嵌合、母体或胎儿基因组中拷贝数变异、双胎中一胎停育、母体存在恶性肿瘤等。因此在临床产前检查工作中，无创产前基因检测只能作为传统血清学筛查方法的有益补充[9]，胎儿染色体诊断还应以细胞遗传学为主。本研究结果发现，无创产前基因检测技术检测21-三体的准确率最高，18-三体、13-三体和性染色体非整倍体的准确率均不高，与夏开德等[10]的研究结果类似，这必造成一部分孕妇因假阳性问题而选择介入性产前诊断。因此，临床上应重视对假阳性问题的处理。

综上所述，无创产前基因检测对于检测21-三体有高准确性，而且具有无创性的优点，但对于18-三体、13-三体及性染色体非整倍体异常的检测准确性还有待提高。在临床工作中使用无创产前基因检测前要充分掌握临床应用指征与做好遗传咨询工作，有效指导优生优育、降低出生缺陷儿和提高人口素质。

参考文献：

[1]唐新华，杨必成，朱姝，等.染色体核型分析与Bo Bs技术联合检测染色体异常和染色体微缺失综合征的产前诊断新模式的建立和应用[J].中华妇产科杂志，2016，51（5）：325-328.

[2]马婷婷，刘华平，候朝晖，等.无创DNA检测技术对胎儿染色体非整倍体疾病的筛查效果[J].空军医学杂志，2015，31（4）：235-239.

[3]柳爱华，宋奉侠，郝明革，等.母血清筛查21-三体、18-三体高风险病例的产前诊断[J].中国产前诊断杂志（电子版），2012（4）：8-10.

[4]郑文吉，范琦慧，陈志央，等.中孕期血清三联筛查唐氏综合症假阴性病例分析[J].浙江预防医学，2015，27（11）：1154-1156.

[5]Lewis C，Hill M，Chitty LS，Women's experiences and preferences for service delivery of non-invasive prenatal testing for aneuploidy in a public health setting：a mixed methods study[J].PLoS One，2016，11（4）：e0153147.

[6]侯桂玉，郭跃文，蒋丽江，等.超声NT、血清学筛查与无创产前基因检测联合筛查高危孕妇胎儿染色体非整倍体580例分析[J].深圳中西医结合杂志，2016，26（10）：21-23.

[7]Lo YM，Corbetta N，Chamberlain PF，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet，1997，350（9076）：485-487.

[8]Gil MM，Quezada MS，Revello R，et al.Analysis of cell-free DNAin maternal blood in screening for fetal aneuploidies ：updated meta-analysis[J].Ultrasound Obstet Gynecol，2015，45（3）：249-266.

[9]侯巧芳，吴东，楚艳，等.孕妇外周血中游离胎儿DNA检测在无创产前诊断中的临床应用[J].中华妇产科杂志，2012（47）：813-814.

[10]夏开德，吴忠琴.无创DNA产前检测高风险的羊水细胞遗传学分析及临床意义[J].中国优生与遗传杂志，2017，25（1）：41-43.

收稿日期：2019-10-17;修回日期：2019-11-05

编辑/钱洪飞