何映华 何荧 周玲艳 潘伟明

摘 要：本研究以发芽4d，生长状况良好，高约4cm的菜心无菌苗为材料，初步研究了菜心幼苗不同部位材料、渗透（甘露醇）浓度、酶解时间、果胶酶、纤维素酶浓度等关键因素对原生质体游离的影响。结果表明，从菜心幼苗的幼叶组织分离原生质体效果比下胚轴好;以w=1.5%的纤维素和w=0.4%的果胶酶为酶解液，在0.8mol/L甘露醇浓度下，40～50r/min的摇床中黑暗酶解4h时，原生质体产量是最高的。

关键词：菜心;外植体;原生质游离;条件优化

中图分类号：S-3

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200415005

收稿日期：2020-03-05

基金项目：广东省科技厅农业攻关项目

作者简介：何映华（1995-），女，本科在读。研究方向：生物技术;通讯作者潘伟明（1969-），男，硕士，研究员。研究方向：植物遗传育种。

菜心（Brassica campestris var. Parachinesis）是十字花科蕓薹属中以菜薹为产品的一种蔬菜，是华南地区栽培规模最大的特产蔬菜之一，在华南地区的蔬菜周年供应及出口创汇中起着举足轻重的作用[1]。每年4—9月份是广东省高温多雨的季节，菜心露地栽培难度大，病虫多发、产量低、品质差[2]。这大大限制了菜心产业的进一步发展，因此迫切需要选育适合华南地区条件生长、抗逆性佳的优良品种。

原生质体由于没有细胞壁，在物理、化学因素诱导下，2个互相靠近的原生质体可发生融合，可以克服远缘杂交不亲和障碍，从而获得杂种株系，服务于作物改良[3]。植物原生质体与植物细胞一样具有全能性，而且可以直接导入外源DNA、细胞器等。因此可以导入特定的基因，从而达到改良作物的品质、抗逆性等目的，是植物遗传转化不可多得的理想受体[3-5]。同时，原生质体也是获得细胞无性突变系的优良材料[6]，可通过定向选择筛选出特异性的变异体。因此，原生质体是实现新品种选育的理想材料。

1980年，麦鹤云等[7]进行了菜心原生质体分离方法的初步探讨，发现菜心叶肉组织在渗透压0.7M（甘露醇），酶液浓度为1%，处理2h时效果较好，90%分离出原生质体。1994年，张兰英等[8]以菜心下胚轴为材料，2%纤维素酶R-10、1%果胶酶R-10、0.5%崩溃酶，25℃黑暗条件下静置3h，再30r/min震荡处理14h游离原生质体，并培养获得植株再生。

2003年，Fan等[9]以菜心花粉粒为材料，1%纤维素酶R-10、0.08%果胶酶Y-23，28℃游离1h获得原生质体。体细胞杂交技术广泛应用于芸薹属植物中，可以有效克服有性杂交不亲和性及雌/雄性不育等常规育种所遇到的问题。同时，体细胞杂交能实现核基因性状及细胞质基因性状的转移重组[10]。

适宜的材料是获得高质量原生质体的前提条件，芸薹属植物用于分离原生质体的材料来源主要有无菌苗的子叶、下胚轴、真叶。酶也是影响植物原生质体分离的关键因素之一，不同的植物种类和外植体材料所用的酶液组合和浓度不同。此外，酶液的渗透压对原生质体的分离也至关重要，适宜浓度的渗透压可维持细胞内外的压力，对原生质体起到保护作用[10]。本研究以“美绿菜心”品种为实验材料，比较了供试材料、酶液浓度、酶解时间以及渗透压等条件游离原生质体的效果，以期获得菜心原生质体游离的最佳条件，从而为菜心体细胞杂交和品种资源创新奠定基础。

1 材料与方法

1.1 无菌苗的获得

实验材料为“美绿菜心”品种。筛选饱满一致的种子，在超净台内，用75%乙醇消毒30s，0.1%L汞浸泡8min，无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分，接种于1/2MS培养基中，每瓶接种40粒，置于25℃，12h/d黑暗条件下进行种子萌发、生长，获得无菌苗。取苗龄3～4d，高约4cm的无菌苗下胚轴和幼叶作为原生质体游离的材料。

1.2 酶液的准备

CPW的配制：KH2PO4 27.2mg/L、KNO3 101mg/L、KI 0.16mg/L、CaCl2·2H2O 1480mg/L、MgSO4·7H2O 240mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MES5moL/L、甘露醇0.5～0.9moL/L，以1moL/LHCl调整pH至5.6。

酶液的配制：以CPW溶液为溶剂，称取一定质量的纤维素酶R-10和果胶酶Y-23，充分溶解后，以细菌过滤器进行过滤灭菌，以用于原生质体的游离。

1.3 原生质体的游离

称取1g叶片或靠子叶端1cm长的下胚轴，用手术刀片将叶片切割成宽0.5mm的细条，下胚轴横切成0.3～0.4mm厚的薄片。将切割好的材料加入到10mL酶解液中，然后置于摇床上轻轻振荡（50rpm/min），黑暗条件下进行原生质体游离。

1.3.1 不同材料的选择

分别以无菌苗的幼嫩子叶和下胚轴为材料，酶液浓度、酶解时间、渗透压浓度等条件一致，比较不同材料菜心原生质体游离的效果。

1.3.2 纤维素酶浓度设置

以无菌苗幼嫩子叶为材料，果胶酶浓度0.4%，甘露醇浓度0.7moL/L，游离时间4h，设置纤维素酶浓度为1.0、1.5、2.0和2.5%，以确定合适的纤维素酶浓度。

1.3.3 果胶酶浓度设置

以无菌苗幼嫩子叶为材料，纤维素酶浓度1.0%，甘露醇浓度0.7moL/L，游离时间4h，设置果胶酶浓度为0.1%、0.2%、0.4%和0.6%，以确定合适的果胶酶浓度。

1.3.4 渗透浓度设置

以无菌苗幼嫩子叶为材料，纤维素酶浓度1.0%，果胶酶浓度0.4%，游离时间4h，设置甘露醇浓度为0.5moL/L、0.6moL/L、0.7moL/L、0.8moL/L和0.9moL/L，以确定合适的渗透浓度。

1.3.5 酶解时间设置

以无菌苗幼嫩子叶为材料，纤维素酶浓度1.0%，果胶酶浓度0.4%，甘露醇浓度0.7moL/L，设置酶解时间为2h、3h、4h、5h、6h和7h，以确定最合适的游离时间。

1.4 原生质体的纯化与计数

酶液中充分离解的原生质体，用45μm孔径的不锈钢筛过滤，滤液通过800r/min离心5min，收集原生质体，弃去上清，沉淀以CPW洗涤2次，得到纯的原生质体，并以CPW重悬原生质体，取0.1mL悬浮液滴加在血球计数板上，在光学显微镜下观察、计数。每个样品计数5个重复，最后计算出每克鲜重材料的原生质体数量。

2 结果与分析

2.1 不同材料对菜心原生质体游离的影响

本实验分别以菜心幼嫩子叶和下胚轴为材料进行原生质体游离。结果表明，菜心幼嫩子叶分离原生质体的得率5.46×106个/g·FW，而以下胚轴为材料几乎没有游离出原生质体。因此，后续實验均以菜心幼苗幼嫩叶片为材料。

2.2 酶液浓度菜心原生质体游离的影响

纤维素酶和果胶酶浓度对菜心原生质体游离的影响如表1。结果表明，不同浓度的纤维素酶和果胶酶对菜心原生质体产量有比较大的影响。对于纤维素酶来说，在一定的浓度范围内，原生质体产量随着纤维素酶浓度的增加而增加，当纤维素酶浓度为1.5%时，菜心原生质体产量最高，为13.5×106个/g·FW;当纤维素酶浓度继续增大时，菜心原生质体产量有所下降。对于果胶酶来说，同样是在一定的浓度范围内，原生质体产量随着果胶酶浓度的增加而增加，当果胶酶浓度为0.4%时，菜心原生质体产量最高，为12.5×106个/g·FW;当果胶酶浓度继续增大，达到0.6%时，菜心原生质体产量明显下降，且明显低于果胶酶0.1%时的原生质体产量。且随着果胶酶浓度的上升，原生质体开始大量出现不规则的形状，原生质体悬浮液中有较多的细胞碎片。综上所述，“美绿菜心”原生质体游离最合适的纤维素酶和果胶酶浓度分别为1.5%和0.4%。

2.3 甘露醇浓度对菜心原生质体游离的影响

甘露醇对菜心原生质体游离的影响如表2。结果表明，渗透浓度对菜心原生质体的产量有明显影响，在一定的浓度范围内，原生质体产量随着甘露醇浓度的增加而增加，当甘露醇浓度为0.5moL/L时，菜心原生质体的产量为11.5×106个/g·FW，且原生质体破裂情况严重，悬浮液中细胞碎片较多;当渗透浓度是0.8moL/L时，菜心原生质体的产量最高，且与甘露醇浓度为0.5moL/L和0.9moL/L时达显著差异。当甘露醇浓度为0.9moL/L时，原生质体产量下降，但原生质体形状、大小一致性好，破碎原生质体少。综上所述，“美绿菜心”原生质体分离最适宜甘露醇浓度为0.8moL/L。

2.4 酶解时间对菜心原生质体游离的影响

酶解时间对菜心原生质体游离的影响如表3。结果表明，在一定的游离时间范围内，原生质体产量随着酶解时间的增加而增加，当原生质体游离时间为2h时，菜心原生质体游离产量为7.0×106个/g·FW，而游离时间达到4h时，菜心原生质体产量达到最高，为11.5×106个/g·FW，与游离时间为2h达到显著差异。随着游离时间的进一步增加，菜心原生质体产量明显下降，表现为原生质体开始大量破裂，悬浮液中细胞碎片明显增多。综上所述，菜心原生质体游离最佳酶解时间为4h。

3 讨论

适宜的植物材料是分离高质量原生质体的前提条件，生长旺盛的组织有利于获得较高的原生质体产量。用于分离芸薹属植物的材料来源主要有无菌苗的子叶、下胚轴、真叶[10]。下胚轴往往被认为是芸薹属植物原生质体分离效果较好的材料来源[11，12]。但孙慧慧[13]以甘蓝型油菜品种（系）中“双6号”下胚轴、子叶和叶片为材料，发现子叶和真叶的原生质体产量比下胚轴高。张兰英等[8]以发芽4d，高约3～4cm的菜心无菌苗下胚轴进行17h的游离获得一定数量的原生质体，并通过培养获得再生植株。本实验比较了叶片和下胚轴的游离效果，结果发现，以下胚轴为材料游离4h时，在显微镜下几乎观察不到原生质体，而幼嫩叶片的游离效果较好，这与张兰英等[8]的结果有一定的出入，可能是其在实验中撕去了下胚轴的表皮，另外使用了崩溃酶（0.5%）和较高浓度的果胶酶浓度（1%），有利于细胞离解而提高了原生质体的游离效果。麦鹤云等[7]以菜心叶肉组织为材料，以1%酶浓度游离1.5～2h获得90%的游离效果，说明叶片是菜心原生质体比较好的材料。

酶是影响植物原生质体分离效果的关键因素之一。常用的主要有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、崩溃酶和离析酶等，纤维素酶使用浓度为1%～2%，果胶酶使用浓度为0.5%～1.0%，酶解时间也从几小时到十几小时不等。不同的植物种类和外植体材料所用的酶液组合和浓度也有差异[14，15]。李贵等[16]以结球甘蓝的无菌苗下胚轴为材料进行原生质体游离时发现，2.5%纤维素酶和0.05%果胶酶组合，酶解时间为16h时，原生质体产量和活力为最高。范春丽等[17]以甘蓝型黄籽油菜子叶和下胚轴为材料进行原生质体游离时发现，1%纤维素酶和0.5%离析酶酶液组合下，其原生质体分离效果最好。本实验中，菜心原生质体最合适的酶浓度是1.5%纤维素酶R-10和0.4%果胶酶Y-23。一般植物原生质体游离的酶解时间在24h以内，酶解时间过短或者过长都会影响原生质体的产量和质量。如，草莓原生质体酶解14h时获得的产量最高，当延长至18h时，其得率比14h时减少了近40%[14]。本实验酶解时间为4h时效果最佳，随酶解时间增长，酶解液中原生质体形状开始出现不规则，细胞开始破碎，产量下降。张兰英等[8]和麦鹤云等[7]分别以菜心的下胚轴和叶肉组织为材料分离原生质体所使用的酶液组织种类和浓度以及获得一定数量原生质体所需酶解时间也不一样。

酶解渗透压对原生质体的分离也至关重要，适宜浓度的渗透压可维持细胞内外的压力，对原生质体起保护作用。渗透压稳定剂主要有甘露醇、山梨醇、葡萄糖等，但以甘露醇最为常用，浓度一般在0.4～0.8mol/L之间[14]。本实验发现当渗透液浓度为0.8mol/L时效果最好。

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（责任编辑 周康）