雷攀登，孙俊，张正竹⋆

（1.安徽农业大学茶及药用植物安全生产重点开放实验室，合肥 230036；2. 安徽农业大学园艺学院，合肥 230036）

茶树腋芽初代培养过程中外植体褐化的控制措施研究

雷攀登1，孙俊2，张正竹1⋆

（1.安徽农业大学茶及药用植物安全生产重点开放实验室，合肥 230036；2. 安徽农业大学园艺学院，合肥 230036）

有效控制外植体褐变是茶树组织培养的关键技术。本文研究了外植体取材季节、切取方法、培养温度和不同抗氧化剂对外植体褐变率的影响。结果表明：春季材料的外植体污染率、褐变率比秋季的低，腋芽萌发率比秋季的高；外植体留部分叶柄、接种前用2.0 g•L-1PVP溶液浸泡30 min、接种后在8℃避光培养16h可以有效降低外植体褐化率。春季材料、合适的外植体类型、培养温度及抗氧化剂的良好组合，有助于提高茶树腋芽初代培养的成功率。

茶树；腋芽；组织培养；褐化

褐化现象在植物组织培养中普遍存在，外植体褐化是植物组织培养的一大难题。在木本植物组织培养过程中，外植体褐化现象普遍发生。褐化的主要原因是外植体组织被切割后，多酚类化合物从切口处向外分泌，多酚氧化酶被激活，多酚类物质被氧化形成褐色有毒的醌类物质，损伤切面迅速变成棕褐色或暗褐色，褐色物逐渐向培养基中扩散，抑制其它酶的活性，毒害整个外植体组织，外植体随之进一步变褐而最终死亡[1,2]。外植体的基因型、外植体年龄、大小、部位、种类、培养基成分、激素水平和培养条件等因素都会影响褐化的发生[3]。在缓解植物组织培养褐化的措施中，除了选择适宜的外植体及培养基外，多采用抗氧化剂或吸附剂处理，常用的抗氧化剂和吸附剂有抗坏血酸、柠檬酸、亚硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和活性炭等[4-6]。

茶叶中含有较多的易被氧化的多酚类物质，所以在组培过程中外植体容易发生褐化，严重时外植体会因褐化而死亡。本文以龙井-43的腋芽为外植体，初步探讨了取材季节、外植体类型、不同抗氧化剂和培养温度对茶树腋芽初代培养时外植体褐化的影响，以期筛选出较好的防褐化措施，为进一步开展茶树组织培养提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与外植体的处理

取龙井-43当年生未木质化或半木质化的健壮新梢，采自安徽农业大学农业园。将采集的新梢用流水冲洗掉表面尘土，用0.1%的多菌灵表面清洗，冲洗干净，室内水培一周。试验时剪成长约1cm的带单个腋芽的茎段，在无菌操作条件下，先用75%酒精消毒约8s，无菌水漂洗3次，再用0.1% HgCl2+0.1%吐温-20在100rpm摇床上消毒8～9min，无菌水漂洗数次。消毒后的材料约10个分置在无菌的培养皿中，进行接种。

1.2 培养基及培养条件

采用1/2 MS为基本培养基，附加BA 2.0 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+ GA33.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂 7.0 g·L-1，灭菌前pH值为5.8。接种后遮光培养7d。光照培养光照周期为16h光照，8h黑暗。培养温度为25±2℃。

1.3 试验处理

1.3.1 取材季节

以春季腋芽和秋季腋芽为外植体，研究了不同季节外植体的污染率、褐化率、萌发率。

1.3.2 对外植体褐化的控制

采用春季材料，对外植体的切取方法进行了研究，外植体采用了：Ⅰ.斜切腋芽，不带茎段和叶；Ⅱ.腋芽带茎段；Ⅲ.腋芽带茎段，留少量叶柄三种处理。带茎段的外植体均是下端斜切，上端平切。

外植体接种于添加不同抗氧化剂的培养基中。各种抗氧化剂的浓度分别为（1）维生素C（Vc）0.5、1.0、2.0 g•L-1；（2）活性炭（AC）0.25、 0.5、1.0 g•L-1；（3）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.5、1.0、2.0 g•L-1。 此外，外植体接种之前，用2.0 g•L-1PVP溶液（过滤除菌）浸泡30 min，然后接种于未添加抗氧化剂的培养基中。

外植体接种后置于8℃避光培养16h，再置于25℃培养，以始终置于25℃培养为对照。

1.3.3 上述各因素的组合效果

待确定了各因素的最佳抑制褐化效果后，将其组合应用于茶树腋芽培养，考察各因素的组合对外植体褐化的抑制效果。

以上每个处理均重复3次。

1.4 评价标准与数据统计

腋芽的萌发状况采用萌动和萌发两个评价标准。萌动，即腋芽膨大，未展开叶；萌发，即腋芽膨大，继而形成新梢，有展开叶。外植体接种后4周左右进行萌动率统计，8周左右进行萌发率统计。

污染率、褐化率分别于接种后7d～15d和3d～7d统计。污染率=（污染的外植体/接种的外植体）×100﹪；褐化率=（褐化的外植体/接种的外植体）×100﹪；无污染率=（无污染的外植体/接种的外植体）×100﹪；萌动率=（萌动的外植体/接种的外植体）×100﹪；萌发率=（萌发的外植体/接种的外植体）×100﹪。

2 结果与分析

2.1不同季节外植体的污染率、褐化率、萌发率比较

表1 不同季节外植体污染率、褐化率、萌发率比较

由表1可知：新梢萌发季节即芽的生育状态对外植体的污染率、褐变率和萌发有很大影响。秋季材料的污染率较高可能是由于腋芽经过了近半年的生长，鳞片较多，潜伏的有害菌较多，外植体表面消毒又很难将其完全杀灭；春季的腋芽生长时间较短，自身带菌较少，消毒相对容易，所以污染率较秋季低。春季新梢多酚类含量比秋梢低，春季外植体的褐化率相比秋季外植体低；秋季的腋芽可以萌动，但是没有伸长形成新梢，春季的腋芽萌发后生长较快，部分腋芽16周就可以生长至6cm。

2. 2 外植体切取方法与培养结果的关系

表2 不同类型外植体褐变率、萌发率比较

试验结果表明（表2），外植体的受伤害程度与褐变程度有较大关系。这主要由于不同的切取方法，留下的伤口面积不同，伤口面积越大，表面消毒剂对外植体伤害越多，褐变程度越重。此外，外植体组织受伤害程度直接影响萌发，腋芽带茎段留部分叶柄的外植体接种两周后就开始萌动，叶柄也会逐渐从基部脱落，第8周外植体萌发率可以达到10.5%，而单独的腋芽萌发率为0。

2. 3 不同抗氧化剂对茶树腋芽褐化的影响

抗氧化剂抑制褐化的作用在其它植物组培中已有许多报道。我们选用了几种抗氧化剂和吸附剂加入培养基中，以及使用PVP溶液浸泡外植体（以不加的培养基为对照），结果表明，培养基中加入维生素C（0.5～2.0 g·L-1）、活性炭（0.25～1.0 g·L-1）、聚乙烯吡咯烷酮（0.5～2.0 g·L-1），均可不同程度减少外植体褐化的发生，抑制效果最佳的是使用2.0g·L-1PVP溶液浸泡外植体30min（表3）。

表3 维生素C、活性炭、聚乙烯吡咯烷酮对茶树腋芽褐变的影响

2. 4 培养温度对茶树腋芽褐化的影响

在试验中发现，把接种后的茶树腋芽分别在高温（25℃）和低温（8℃）条件下培养，高温培养可明显促使褐化的发生，褐化率达 38.7%，而低温条件下褐化率为20.6%。因为高温能促进多酚氧化酶的生物活性，从而促进多酚类物质的氧化，加速外植体褐化，而低温可以抑制酚类化合物的合成，降低多酚氧化酶的活性，抑制多酚类氧化，从而减轻外植体褐化。

2. 5 上述因素组合效果的考察

春季茶树新梢为材料，腋芽带茎段留少量叶柄为外植体，培养基中不添加任何抗氧化剂和吸附剂。考察外植体接种前在2.0 g·L-1PVP溶液浸泡30min、接种后在8℃条件下避光处理16h对外植体褐化的抑制效果。以外植体直接接种且接种后直接置于25±2℃培养为对照。

试验结果发现，各因素组合后外植体褐化率为8.9%，对照的褐变率29.3%，外植体的褐化率显著降低。

3 讨论

在影响茶树腋芽褐化的众多因素中，本试验首先对培养材料的生长季节和生理状态进行了选择，因为植物的不同生长季节和生理状态在组织培养中发生褐变的频率和程度都存在很大的差别。外植体在不进行任何褐化控制的条件下培养，根据培养的结果（表1），筛选出褐化发生轻、污染率低、萌发率高的春季茶树腋芽作为适宜的培养材料。在参考了茶树[7,8]、油茶[5]、核桃[4]组织培养方面的研究结果后，确定了1/2MS为基本培养基，附加BA 2.0mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+ GA33.0 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 琼脂7.0 g·L-1，作为茶树腋芽初代培养的的培养基。

外植体组织受伤害程度直接影响褐化和萌发（表2），与单独腋芽的作为外植体相比，腋芽带茎段留少量叶柄的外植体，其褐化率明显降低，萌发率也较高。

本试验通过在培养基中添加不同种类和浓度的抗氧化剂对抑制褐变的效果进行研究，其总体结果为PVP ＞Vc ＞AC，且均比对照好，尤其是接种前使用2.0 g·L-1PVP溶液浸泡外植体30min抑制褐化的效果最佳。这与对油茶[5]和中国李[6]的研究结果较为一致。

在初代培养时把外植体处于不适合酚类合成或降低多酚氧化酶活性的条件下，如在黑暗或弱光及低温下培养，可抑制多酚类物质的氧化，从而减轻外植体褐化。在“薄壳香”核桃[4]的愈伤组织诱导时，把外植体分别培养在高温（25±2℃）和低温（18±2℃）条件下培养，高温培养褐化率达52.7%，而低温条件下褐化率为29.8%。油茶茎尖[5]在l0℃恒温箱中处理3d后再置于（25±2℃）的室内培养，可在一定程度上减轻外植体的褐化反应。

春季材料适宜做腋芽培养，可以降低外植体的污染率与褐变率，提高腋芽萌发率。腋芽带茎段留部分叶柄、外植体接种前在2.0 g·L-1PVP溶液浸泡30min、接种后在8℃条件下避光处理16h能够明显减轻褐化。

[1] 张红晓,经剑颖.木本植物组织培养技术研究进展[J].河南科技大学学报(农学版),2003,23(3):66～69.

[2] 翟晓巧.木本植物组织培养褐化控制策略[J].河南林业科技,2008,28(1):38～40.

[3] 高国训.植物组织培养中褐变问题[J].植物生理学报,1999,25(6) :501～506.

[4] 刘兰英.薄壳香核桃组培中的褐化及防止措施研究[J].园艺学报,2002,29(2):171～172.

[5] 阙生全,彭凌,朱必凤,等.油茶组织培养过程中防止褐变的研究[J].韶关学院学报(自然科学版), 2006,27(3) : 67～69.

[6] 邹英宁,李国怀,樊青峰,等. 不同抗氧化剂对中国李茎段培养的影响[J]. 华中农业大学学报, 2006,25(1) : 84～86.

[7] 周健,成浩,王丽鸳.茶叶组培快繁技术的优化研究[J].茶叶科学,2005,25(3) :172～176．

[8] Mondal TK, Bhattacharya A, Laxmikumaran M, Ahuja PS. Recent advances of tea (Camellia sinensis) biotechnology[J]. Plant Cell Tiss Org Cult, 2004, 76: 195～254.

S336

A

1006-5768(2010)03-0101-04

2010-05-06

雷攀登（1983- ），男，安徽萧县人，硕士研究生，研究方向：茶叶生物化学及天然产物研发。*

zzz@ahau.edu.cn。