陈桂柳，卢靖，李嘉颖，江嘉敏，林梦哲，陈颖琪，张宏梅

(广东工业大学 生物工程系，广州 510006)

食源性微生物引起的疾病是全球食品安全的核心问题[1]。食源致病菌可以通过复杂的生产、流通、储存等环节进入到食品中，对消费者的健康产生极大的威胁，当前许多科学研究者致力于探索其解决办法[2]。生物被膜是指微生物吸附于惰性物体表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白和DNA等胞外基质(extracellular polymeric substances，EPS)，相互粘连并将其菌落聚集缠绕其中形成的膜样物，是微生物为适应胁迫环境所形成有利于生存的一种特殊生长状态[3]。以往的科学实验研究中，人们往往关注的是游离态致病菌的特征及其控制方法。事实上，自然界中的微生物大部分以生物被膜态形式存在。相对于浮游态菌体，生物被膜菌体对热、消毒剂以及紫外等灭菌方式产生很强的抗性，彻底清除该致病菌已然成为一个难点，当前还没有研究出一种可以完全抑制或完全清除杀灭的方法，致使食品交叉污染和周期污染问题频繁发生[4]。

近年来随着消费者对食品加工中采用天然有效并具有安全保障的食品防腐剂的需求增加，相关人员也不断地从各种传统食品中寻找天然抗菌防腐成分以满足食品工业的需求[5,6]。肉桂醛和龙脑是国家批准作为香味用途的食品添加剂，已有报道显示其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等致病菌具有一定的抑制作用，但是在目前的文献资料中，对于游离态和生物被膜态的食源致病菌的抑制作用则鲜有报道[7,8]。因此，本研究拟以天然产物右旋龙脑和肉桂醛为抑菌剂，分析其对游离态和生物被膜态的单核增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌特性，为探索天然产物中安全、有效的抑菌剂提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与主要试剂

单核增生李斯特菌(L.monocytogenesATCC 13932)、鼠伤寒沙门氏菌 (SalmonellatyphimuriumATCC 14028)：均由广东工业大学生物工程实验室提供，保存于-80 ℃。

右旋龙脑：华南理工大学轻工与食品学院苏建裕实验室提供；肉桂醛：阿拉丁试剂有限公司；胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)：广东环凯微生物科技有限公司；PALCAM琼脂以及木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(xylose lysine desoxycholate agar，XLD)：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶剂无水乙醇杀菌效果的研究

将上述菌种各10 μL接种于TSB培养基的试管中，于37 ℃、180 r/min摇床中培养24 h。将菌液浓度调为OD630为0.8(菌体浓度大约为9 log CFU/mL)。将活化好的两种菌液按1∶1混合。配制无水乙醇和TSB培养基比例分别为1∶18、1∶19、1∶20、1∶21、1∶22的混合液。以TSB培养基为空白对照。吸取2 mL上述溶液于试管中，混合均匀后接种单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌及其混合菌各5 μL，于37 ℃恒温培养24 h。PALCAM琼脂和XLD琼脂分别对单核增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌进行计数[9,10]。以乙醇浓度不影响菌体生长的浓度为合适乙醇浓度。

1.2.2 右旋龙脑和肉桂醛单独以及混合添加对游离态食源致病菌的最低抑菌浓度的测定

浮游态菌体最低抑菌浓度采用改良的临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的肉汤微稀释法测定[11]。用0.22 μm滤膜过滤右旋龙脑溶液后将其与TSB培养基按1∶21的体积比进行混合，使右旋龙脑溶液的终浓度为0.60，0.58，0.56，0.54 mg/mL。参照Rode等[12]的办法，吸取不同浓度的右旋龙脑溶液200 μL于96孔板中，按1∶100的比例分别加入2 μL上述3种菌液。设定右旋龙脑浓度为0的加菌液的孔和只含右旋龙脑的TSB培养基的孔作为对照。置于37 ℃培养箱中培养24 h后，用酶标仪测定OD630值。

配制终浓度为1.60，0.80，0.40，0.20 μL/mL的肉桂醛溶液，测定OD630值。

配制终浓度为0.50 mg/mL的右旋龙脑，0.40 mg/mL的右旋龙脑。0.40 μL/mL的肉桂醛，0.30 μL/mL的肉桂醛，0.50 mg/mL的右旋龙脑和0.40 μL/mL的肉桂醛，0.40 mg/mL的右旋龙脑和0.30 μL/mL的肉桂醛，添加等量的无水乙醇做空白对照组。用PALCAM琼脂和XLD琼脂进行计数。

1.2.3 右旋龙脑和肉桂醛协同作用下对生物被膜态菌体最低抑菌浓度的测定

参照Azeredo等[13]的研究，在装有2 mL TSB培养基的4支试管中，分别接种上述3种菌液各5 μL，其中一支试管不加任何菌液作为空白组。在37 ℃恒温静置培养48 h，以形成成熟的生物被膜。

在4支试管中配制浓度为2.50 mg/mL的右旋龙脑和2.00 μL/mL的肉桂醛，2.00 mg/mL的右旋龙脑和1.60 μL/mL的肉桂醛，1.50 mg/mL的右旋龙脑和1.20 μL/mL的肉桂醛，添加等量的无水乙醇作为空白对照组。48 h后，小心移去上层菌液，避免破坏生物被膜。沿试管壁添加100 μL无菌水清洗2次。然后吸取上述药物各200 μL添加到试管中，于37 ℃培养24 h。24 h后，小心移去上层菌液。向试管加入200 μL TSB。密封处理后放到80 Hz的数控超声清洗器超声15 min。吸取菌液于试管后，于37 ℃恒温培养6 h后用PALCAM琼脂和XLD琼脂进行计数。

1.3 数据统计与分析

每组试验均重复3次，采用Excel 2010进行数据分析和统计。

2 结果与分析

2.1 溶剂无水乙醇杀菌效果的研究

右旋龙脑与肉桂醛都是难溶于水但溶于无水乙醇的物质。无水乙醇本身就对微生物有杀伤菌体作用,因此需要找到既能溶解右旋龙脑和肉桂醛又能不抑制微生物生长的剂量。

表1 不同无水乙醇比例的杀菌效果Table 1 Bactericidal effect of different proportions of anhydrous ethanol

注：“+”表示平板内有1～100个肉眼可见的菌落，“++”表示有100～200个肉眼可见的菌落，“+++”表示有200～400个肉眼可见的菌落，“++++”表示存在400 个以上肉眼可见的菌落，“-”表示没有肉眼可见的菌落。

由表1可知，当比例为1∶20时，它们的生长受到抑制。当比例为1∶21时，右旋龙脑与肉桂醛可以在这个体系充分溶解并且菌体的生长开始不受到影响。

综上所述，在无水乙醇与TSB的比例为1∶21时，乙醇的灭菌作用可以忽略不计，并且这时右旋龙脑与肉桂醛可以在这个体系充分溶解。

2.2 右旋龙脑对游离态菌体最低抑菌浓度的测定

表2 单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌及混合菌的OD630值Table 2 OD630 values of L.monocytogenes,S.typhimurium and mixed bacteria

由表2可知，由不加右旋龙脑时的OD630值可知3种菌在不加右旋龙脑时都能正常生长。右旋龙脑浓度为0.54～0.60 mg/mL时，3种菌的OD630值都有明显的减少，说明右旋龙脑对3种菌的生长均有抑制作用。李振等[14]的研究以南北五味子对沙门氏菌的MIC分别为62.5，31.3 mg/mL，说明南北五味子对沙门氏菌具有抑菌作用。可见，本研究中右旋龙脑具有更强的抑菌效果。

对于单核增生李斯特菌而言，当右旋龙脑浓度为0.56 mg/mL时，其OD630值为0.094，对于鼠伤寒沙门氏菌来说，当右旋龙脑浓度为0.58 mg/mL时，其OD630值为0.074；对于混合菌来说，当右旋龙脑浓度为0.60 mg/mL时，其OD630值为0.082，均与阴性对照接近，综上所述，用选择培养基进行验证后确定，右旋龙脑对单核增生李斯特菌的MIPC为0.56 mg/mL，对鼠伤寒沙门氏菌的MIPC为0.58 mg/mL，对混合菌的MIPC为0.60 mg/mL。结果表明右旋龙脑对单核增生李斯特菌的抑制效果强于对鼠伤寒沙门氏菌的抑制效果，还显示当两种菌混合培养时，其对右旋龙脑产生的抗性比单一菌培养产生的抗性要强,说明混合菌体比单一菌体具有更强的适应性，这和已有报道一致[15]。

2.3 肉桂醛对游离态菌体最低抑菌浓度的测定

表3 单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌及混合菌的OD630值Table 3 OD630 values of L.monocytogenes,S.typhimurium and mixed bacteria

由表3可知，当肉桂醛浓度为0.40 μL/mL时，单核增生李斯特菌的OD630是0.088，鼠伤寒沙门氏菌的OD630是0.097，混合菌的OD630是0.105，其阴性对照的OD630是0.099，三者的吸光值均与阴性对照相接近，说明在该浓度下无菌生长，肉桂醛对致病菌具有抑菌作用 。

综上所述，用选择培养基进行验证后确定单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌与混合菌的MIPC都为0.40 μL/mL。

2.4 右旋龙脑和肉桂醛协同作用下对游离态菌体最低抑菌浓度的测定

表4 单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌以及混合菌的生长情况Table 4 Growth situation of L.monocytogenes,S.typhimurium and mixed bacteria

注：“+”表示平板内有1～100个肉眼可见的菌落，“++”表示有100～200个肉眼可见的菌落，“+++”表示有200～400个肉眼可见的菌落，“++++”表示存在400 个以上肉眼可见的菌落，“-”表示没有肉眼可见的菌落。

由表4可知，在0.50 mg/mL右旋龙脑和0.40 μL/mL肉桂醛共同作用下可以完全杀死3种菌体。而0.50 mg/mL的右旋龙脑不足以完全杀死3种菌但可较好地抑制游离态菌体的生长。0.40 μL/mL的肉桂醛只能杀死单核增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌，对混合菌只有部分抑制作用。结果表明右旋龙脑和肉桂醛可以协同抑制游离态菌体的生长。用选择培养基验证后，确定右旋龙脑和肉桂醛协同的MIPC为0.50 mg/mL右旋龙脑和0.40 μL/mL肉桂醛。Visvalingam等[16]的研究表明肉桂醛和其他试剂协同作用，增强抑菌作用的同时还可以降低产生抗药性的风险。

2.5 右旋龙脑和肉桂醛协同作用下对生物被膜态菌体最低抑菌浓度的测定

表5 单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌以及混合菌的生长情况Table 5 Growth situation of L.monocytogenes,S.typhimurium and mixed bacteria

注：“+”表示平板内有1～100个肉眼可见的菌落，“++”表示有100～200个肉眼可见的菌落，“+++”表示有200～400个肉眼可见的菌落，“++++”表示存在400 个以上肉眼可见的菌落，“-”表示没有肉眼可见的菌落。

由表5可知，在3倍MIPC共同作用下可以完全将单核增生李斯特菌杀灭，而鼠伤寒沙门氏菌和混合菌却还存在少数菌。鼠伤寒沙门氏菌和混合菌要在5倍MIPC共同作用下才会被彻底杀死。说明右旋龙脑和肉桂醛可以抑制生物被膜态菌体的生长，在以往的研究中已经显示肉桂醛可以抑制生物被膜的形成[17]。在2.50 mg/mL右旋龙脑和2.00 μL/mL肉桂醛的环境下，生物被膜态的3种菌的生长均被完全抑制。综上所述，经选择培养基验证后，确定右旋龙脑和肉桂醛协同作用下的MIBC为2.50 mg/mL右旋龙脑和2.00 μL/mL肉桂醛。由结果可知，抑制生物被膜态菌体的药物浓度远远高于游离态的药物浓度，这一点在以往的实验中也已经得到证实[18]，同时也证明了生物被膜态菌体具有更强的药物抗性。

3 结论

食源致病菌的污染导致的食品安全问题是人类健康的一大隐患。游离态菌体和生物被膜态菌体对各种杀菌条件的敏感度不同，生物被膜的形成增加了食品中致病菌清除的艰巨性。本研究探讨了右旋龙脑、肉桂醛、右旋龙脑和肉桂醛混合添加抑制游离态和生物被膜态的单核增生李斯特菌、沙门菌及其混合菌的特性。试验结果显示，右旋龙脑、肉桂醛以及两者混合添加对游离态和生物被膜态两种生理状态的食源致病菌都具有一定的抑制作用。而且两者混合添加时具有协同的作用，在降低其使用浓度的同时增强了其抑菌效果。因此，即使肉桂醛和右旋龙脑都有刺激性气味，但混合添加两种天然食品添加剂，在协同作用下，可以降低它们对食品风味的影响。本研究对今后开展天然食品添加剂在食品工业中的应用具有重要意义。