贾龙刚，王 英，路福平，刘夫锋

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种典型的中枢神经系统慢性病[1].世界帕金森病协会统计资料显示，目前全球已有500 多万PD 患者，是继脑卒中后遗症、癫痫之后危害神经系统的第3 大类疾病.据报道[2-3]：每年每10 万人中就有10～18 个人患PD，其中男性与女性患者比例约为3﹕2.随着年龄增长，发病率会逐年增加，80 岁以上发病率和年龄呈指数增长.预计[4]到2030 年，全球50 岁以上中老年人中，PD 患者将达870～930 万.

虽然对于PD 的发病机制和致病机理尚未完全解析，但现有研究[5-6]表明多种因素参与其中，包括细胞自发性过程如自噬和溶酶体功能障碍等.PD 的主要病理特征是在病人黑质致密部或其他有颜色的核心结构的多巴胺能神经元中含有一种嗜酸性细胞质内含物，即路易小体，而α-突触核蛋白(α-synuclein，α SN)是路易小体的主要成分[7-8].α SN 能够聚集形成一系列大小和形状各异的聚集体，这些聚集体会毒害细胞、破坏神经信号传递，从而与PD 的发生发展密切相关[7].因此，α SN 的聚集及其抑制剂开发就成为近年来的研究热点.

目前，该蛋白的来源主要有以下两种：生物表达法和组织提取法.Zhao 等[9]将α SN 基因连接至pET15b 载体中，在大肠杆菌中表达获得含有标签的融合蛋白，利用TEV 蛋白酶将融合标签切除后获得α SN.然而，切除标签的过程复杂，后期还需经过离子交换、分子筛、Ni 柱亲和层析等繁琐的纯化步骤，效率较低.另外，乙酰基修饰的α SN 也在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达，重组细胞经蒸煮和硫酸铵沉淀法得到粗蛋白，再依次经过离子交换层析和凝胶过滤层析获得较纯的α SN 蛋白[10].然而，蒸煮过程中可能造成蛋白失活或沉淀，同时多步骤纯化会大大降低蛋白的产量.综上所述，目前α SN 的表达纯化方法尚存在步骤繁琐和产量较低等问题[11].这些均制约着对α SN 聚集特性研究及相关抑制剂的开发.

本研究提供了一种简便高效的在大肠杆菌中表达纯化α SN 的方法，优化了表达及纯化条件，并通过硫磺素T(ThT)荧光实验分析了该重组蛋白的聚集特性，利用细胞毒理学实验研究了α SN 聚集体的细胞毒性.

1 材料与方法

1.1 材料

本实验室保存的大肠杆菌(Escherichia coli)Jm109 和BL21(DE3)用于本研究中α SN 的表达.

表达载体质粒pET22b，Novagen 公司；Ni-NTA琼脂糖树脂，Qiagen 公司；高保真DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶及限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ，宝生物工程(大连)有限公司；质粒小量提取试剂盒，北京索来宝科技有限公司；硫磺素T(ThT)，Sigma 公司；表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，Tocris 公司；其他试剂均为分析纯，上海生工生物工程股份有限公司.

1.2 DNA 片段、引物设计合成及pET-α SN 表达载体的构建

根据α SN 氨基酸序列，经密码子偏好性优化后获得相应DNA 序列.DNA 片段、PCR 引物和测序由苏州金唯智公司完成.

将合成的α SN 基因用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收酶切产物α SN，与具有相同黏性末端的pET22b 载体于16 ℃连接4 h；转化大肠杆菌Jm109感受态细胞，37 ℃培养12 h；挑取阳性转化子进行菌落PCR 验证(NdeⅠ-F：GGAATTCCATATGGATGTG TTTATGAAAGGCCT，XhoⅠ-R：CCGCTCGAGGGC TTCCGGTTCATAATCCT)，并提取质粒进行测序鉴定.

1.3 重组α SN 表达及纯化

将上述构建好的重组质粒pET22b-α SN 转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得转化子BL21-α SN，37 ℃静置过夜培养.挑取单菌落至5 mL LB 培养基中37 ℃培养过夜.按1%接种量转接至200 mL 新鲜LB 培养基中，37 ℃培养至A600＝0.6～0.8.然后，加入终浓度0.5 mmol/L IPTG 诱导，诱导温度为16 ℃或 37 ℃，诱导 时 间分 别 为 16 ～18 h 或 4 h.6 000 r/min 离心10 min 收集菌体.BL21 为对照组，诱导条件：IPTG 浓度0.5 mmol/L，诱导温度16 ℃，诱导时间18 h.

用裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，1 mmol/L DTT)将上述所得菌体重悬，加入终质量浓度为30µg/mL的溶菌酶和体积分数为 1%的苯甲基磺酰氟(PMSF)，冰浴30 min 后超声破碎(超声功率250 W，开启 2.5 s，关闭 3 s，总时间 15 min).4 ℃、12 000 r/min 离心30 min，收集上清液.将上清液与Ni+树脂在4 ℃下结合30 min 后加入到亲和层析柱中.待流出液完全流出后，用10 倍柱体积含不同浓度咪唑的清洗液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，咪唑浓度分别为 10、20、30、40 mmol/L，1 mmol/L DTT)洗涤树脂，最后用10 倍柱体积的洗脱液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，100 mmol/L 咪唑，1 mmol/L DTT)洗脱，最终获得目标蛋白溶液.

1.4 SDS-PAGE检测

取20µL 上述各组分样品，加入5µL 蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min 后离心，取上清液进行检测.电泳过程：60 V 保持30 min，调节电压至120 V，约1 h 后停止电泳.将凝胶取下，切除浓缩胶部分，将剩余胶块放入考马斯亮蓝染液中，室温染色30 min，之后将胶块置于漂洗液中过夜漂洗.

1.5 Dot blot检测

取诱导后的BL21 和BL21-α SN 细胞破碎上清液及沉淀，沸水浴10 min 后离心，取2µL 上清液滴定至PVDF 膜上.另外选择带有His 标签的脂肪酶蛋白作为阳性对照，同样取2µL 上清液滴到PVDF 膜上，待晾干后将PVDF 膜放入5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h.之后用pH 8.0 的TBS-T 缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，体积分数0.05%吐温20)清洗4 次.将封闭后的PVDF 膜放入鼠抗His 抗体溶液中，4 ℃过夜孵育.将孵育一抗后的PVDF 膜用TBS-T 缓冲液(pH 8.0)清洗4 次，放入羊抗鼠抗体IgG 中，室温孵育2～3 h.经TBS-T 缓冲液清洗4 次后，用化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)检测结果.抗体稀释倍数均为 1﹕10 000，一抗用5%脱脂奶粉溶液稀释，二抗IgG 用TBS-T 缓冲液稀释.

1.6 MALDI-TOF质谱检测

将上述SDS-PAGE 蛋白胶中目标蛋白条带切下，置于1.5 mL EP 管中，送至天津国际生物医药联合研究院分析测试中心进行质谱分析.

1.7 硫磺素T荧光检测

利用ThT 荧光实验来检测α SN 聚集特性[12-13]，α SN 采用非原位培养法.取适量上述α SN 冻干粉，用20 mmol/L TBS 缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 5.4，150 mmol/L NaCl)溶解，超声10 min 后，4 ℃、16 000 r/min 离心20 min，取上层溶液体积的75%.利用Nanodrop 2000(美国Thermo Fisher Scientific 公司)检测蛋白浓度，并配成终浓度为50µmol/L 的α SN 溶液.将上述溶液在含与不含EGCG 条件下置于37 ℃摇床180 r/min 振荡培养.

ThT 溶液同样利用TBS 缓冲液配制，终浓度为250µmol/L.在不同时间点分别取10µL 上述培养液，加入90µL ThT 溶液，充分混匀.利用Infinite 200 PRO 多功能酶标仪(奥地利TECAN 公司)检测各样品荧光强度，激发波长为440 nm，发射波长为485 nm.

1.8 MTT实验分析重组α SN 的细胞毒性

利用MTT 比色法来检测α SN 聚集体的细胞毒性.首先用DMEM 培养基(10% FBS，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 IU/mL 青霉素和100µg/mL 的链霉素)在37 ℃、5% CO2培养箱中培养PC12 细胞.然后将细胞接种于96 孔板中(5 000 个/孔)，培养24 h 后，加入已培养5 d 的待测样品，使得蛋白的终浓度为5µmol/L.细胞中加入相同体积PBS 缓冲液为空白对照组.共培养 48 h 后，加入终质量浓度为0.5 mg/mL 的MTT 溶液，继续培养4 h 后取出.离心后丢弃上清液，加入100µL DMSO 溶解细胞，37 ℃孵育10 min 后利用多功能酶标仪检测上述样品在570 nm 处的吸光度.

2 结果与讨论

2.1 pET22b-α SN 表达载体及重组α SN 工程菌的构建

α SN 含140 个氨基酸，相对分子质量约为1.5×104[14].α SN 的N 端(1—60 位氨基酸)包含一个高度保守肽段KTKEGV，这种重复序列是典型的载脂蛋白结合域[15].C 端(96—140 位氨基酸)序列中富含酸性氨基酸残基和脯氨酸.中间61—95 位氨基酸序列为非β-淀粉样蛋白组分区域(NAC)，该肽段在α SN聚集过程中扮演重要角色[16-17].首先基于大肠杆菌密码子偏好性，对目标基因进行密码子优化，获得完整的α SN cDNA 序列.将合成的α SN 基因片段与含有相同黏性末端的表达载体框架pET22b 连接，构建pET22b-α SN 表达载体(图1(a)).连接产物转化大肠杆菌Jm109，转化子经菌落PCR 验证，结果如图1(b)所示.图中结果显示4 个转化子的PCR 产物大小与α SN 基因(429 bp)理论值一致.提取质粒进一步测序验证，结果显示未发生突变，证明表达载体构建成功.

图1 表达载体pET22b-α SN 的构建Fig.1 Construction of expression plasmid pET22b-α SN

将上述验证正确的表达载体质粒pET22b-α SN转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，获得重组工程菌，命名为BL21-α SN.

2.2 α SN 蛋白表达及鉴定

上述构建好的BL21-α SN 工程菌利用IPTG 进行诱导表达，收集菌体经细胞破碎后，SDS-PAGE 分别检测细胞破碎上清液和沉淀，结果如图2(a)所示.目标蛋白主要位于破碎上清液中，沉淀中少量的目标蛋白可能是由于破碎不完全或分离不完全造成的，而空白对照组BL21 野生菌的细胞破碎上清液和沉淀都没有目的条带，说明α SN 已成功可溶性表达.图2(a)中显示目的条带大小约为2.0×104，与理论大小(1.5×104)有一定的差距，这主要是由目标蛋白C 端的酸性氨基酸区域结合SDS 能力较弱所造成的[18].

图2 α SN 的表达及鉴定Fig.2 Expression and identification of α SN

为验证目标产物为α SN，将目标蛋白条带切下，利用MALDI-TOF 质谱鉴定，结果如图2(b)所示.荷质比为1 295.69 的肽段为α SN46-58(理论相对分子质量为1 295.70)，荷质比为1 478.77 的肽段为α SN81-96(理论相对分子质量为1 478.78)，荷质比为2 157.16的肽段为α SN59-80(理论相对分子质量为2 157.0).目标蛋白实际检测理论相对分子质量为15 518.8，与理论相对分子质量(15 515.7)基本一致.基于上述结果，可以确定所得目标蛋白为α SN.利用免疫点印迹法进一步验证，结果如图2(c)所示，重组α SN 具有较强的His 免疫原性，进一步表明目标蛋白已成功表达.

2.3 α SN 蛋白表达纯化条件优化

为提高目标蛋白表达量，对诱导温度和诱导时间分别进行优化，结果如图3(a)所示.当诱导温度为37 ℃、诱导时间为4 h 时，目标蛋白的产量相对较高.因此，后期诱导条件选择诱导温度为37 ℃，诱导时间为4 h.由于利用pET22b 质粒表达的蛋白C 端含有His 标签，因此利用Ni-NTA 亲和层析柱纯化目标蛋白.对漂洗液中咪唑浓度进行优化，结果如图3(b)所示，当漂洗液中咪唑浓度为20 mmol/L 时纯化效果最好.利用优化好的条件，每升菌液可获得α SN蛋白54.9 mg，纯度约为96.4%(利用Image J 软件分析).

图3 α SN 蛋白表达及纯化条件优化Fig.3 Optimization of the expression and purification of α SN

2.4 α SN 蛋白聚集特性及细胞毒理学分析

ThT 荧光染色技术常用于检测淀粉样蛋白的聚集特性和筛选淀粉样蛋白聚集抑制剂[12-13].本研究同样利用该技术来分析重组α SN 蛋白的聚集特性，并利用已知的聚集抑制剂EGCG 进一步验证.ThT荧光实验结果如图4(a)所示.从该图可以看出，α SN的ThT 曲线呈现典型的“S”型淀粉样蛋白聚集曲线，共分为3 个阶段：0～72 h 处于迟缓期，72 h 后进入纤维快速伸长期，96 h 后进入稳定平台期.当不同浓度EGCG 与α SN 共培养时，ThT 荧光信号强度始终较小，说明EGCG 抑制了α SN 聚集，从而导致其ThT 荧光信号的强度降低，与前期研究结果一致[19].

利用MTT 实验进一步研究了重组α SN 聚集体的细胞毒性.将培养5 d 的α SN 聚集体与PC12 细胞共培养，检测细胞存活率.如图4(b)所示，当目标蛋白与PC12 细胞共培养时，细胞存活率为对照组的59.47%，证明α SN 聚集形成的聚集体具有较强的细胞毒性.当等浓度EGCG 和α SN 共同处理细胞时，细胞的存活率提高了约11%.上述结果表明EGCG 抑制了α SN 的聚集，并降低了α SN 聚集体的细胞毒性.

综上所述，该重组α SN 具有良好的聚集性和细胞毒性，因此可应用于筛选聚集抑制剂的研究.

图4 重组α SN 蛋白的特征描述Fig.4 Characterization of recombinant α SN

3 结 语

本文开发了一种简便、高效的α SN 表达纯化方法，实现了该蛋白的可溶性表达.经优化表达及纯化条件，提高了α SN 的产量，最终每升菌液可获得54.9 mg，纯度约为96.4%的目标蛋白.ThT 和MTT实验进一步证明该重组α SN 具有良好的聚集性，且聚集体具有较强的细胞毒性.本研究为探索α SN 的聚集特性及筛选聚集抑制剂提供了性质优良的生物材料.