高 霖，刘 犇,2*，彭瑞妮,2，章志涛,2，张雯苑，李国生，梅 婷，邹剑伟,2

（1.宜春学院生命科学与资源环境学院，肉牛羊疾病控制实验室，江西宜春 336000；2.江西绿科农牧科技有限公司，江西宜春 336000）

随着集约化畜牧业的发展[1]、引种和屠宰需求增加，动物往往需要经历运输[2]，运输使动物暴露于一系列不良刺激之下，会引起机体发生多种生理和生化反应，如躁动不安、呼吸与心跳加速，机体内营养、水分大量消耗，同时影响动物的生长发育和生产性能，免疫力降低，导致发病甚至死亡[3-5]。随着国内外畜禽贸易的发展，动物调运日益频繁，运输应激造成的经济损失也越来越大，已经成为我国畜牧业快速发展的重要制约因素[6]。

小肠同时具有消化、吸收营养物质和免疫屏障功能。因此，小肠黏膜结构及其免疫相关细胞的数量变化可以很好地反映肠道黏膜免疫系统的功能状态及小肠的局部免疫状态[7-8]。以往国内外对动物小肠黏膜结构及其免疫相关细胞的研究较多[9-11]，但在运输应激对小肠黏膜结构及其免疫相关细胞的影响方面研究较少。本研究旨在分析短时间和长时间2 种不同运输应激对山羊小肠黏膜结构和淋巴细胞、杯状细胞、肥大细胞数量及分布的影响，为深入研究畜禽运输应激发病机理及解决方案提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物 在江西当地山羊养殖场选择精神状态与健康状况良好、体况相近、体重为（13.89±2.96）kg 且经布鲁氏菌病检测为阴性的赣西公山羊18 头。

1.2 试验设计 将18 头山羊随机平均分成3 组，即对照组、2 h 运输处理组和6 h 运输处理组。装载前在正常条件下饲养山羊，对照组山羊不做处理；运输处理组山羊人工保定好装载到运输车辆上，装载密度为1.5 m2/只，于06:00—12:00 进行运输应激处理。运输应激处理时天气晴好、车内温度约25～30℃，且山羊在运输时禁食禁水，以35～45 km/h 的速度进行公路运输。然后分别在运输应激处理2 h（08:00）和6 h（12:00）后抓羊并卸载，对山羊使用速眠新肌肉注射麻醉，屠宰后分别取十二指肠、空肠、回肠中段各约5 cm，用4℃ PBS 洗净后迅速放入4%多聚甲醛中用于后续常规染色和组织化学染色分析。

1.3 检测指标和方法 将各肠段组织石蜡包埋制备连续切片，每隔10 张选取1 张。每只山羊随机选择5 张切片，经苏木精-伊红（HE）、甲苯胺蓝-高锰酸钾（MTB）以及过碘酸-雪夫氏（PAS）染色后，在光学显微镜下进行观察。在每张切片中随机选择5 根典型肠绒毛，运用图像分析软件对绒毛高度和隐窝深度进行测量，然后计算绒毛高度/隐窝深度的比值（绒腺比）；分别在各肠段的每张切片中随机选取5 根柱状细胞排列整齐、完整性较好的典型肠绒毛，在光学显微镜下计算所选每根肠绒毛中的肥大细胞数量，计算所选每根肠绒毛中分布的上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量。

1.4 统计分析 用SPSS 24.0 对数据进行单因素方差分析。若F 检验结果显著则再用LSD 法进行多重比较，数据以平均值±标准差表示。P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结 果

2.1 运输应激对山羊十二指肠黏膜结构及其免疫相关细胞数量的影响 由表1 及图1 可知，对照组及各运输处理组间十二指肠绒毛高度均无显著变化；与对照组相比，2 个运输处理组隐窝深度均极显著增大，6 h 运输处理组也极显著大于2 h 运输处理组；对照组、2 h 和6 h 运输处理组绒腺比依次减小，3 组间差异极显著。对照组、2 h 和6 h 运输处理组上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量依次增加，3 组间差异极显著；与对照组相比，2 个运输处理组肥大细胞数量均极显著增加，其中6 h 运输处理组极显著少于2 h 运输处理组。

2.2 运输应激对山羊空肠黏膜结构及其免疫相关细胞数量的影响 由图2、表1 可知，与对照组相比，运输处理组绒毛高度均极显著减小，但2 个运输处理组间差异不显著；与对照组相比，6 h 运输处理组隐窝深度极显著增大，2 h 运输处理组无显著变化；对照组、2 h 运输处理组和6 h 运输处理组的绒腺比依次减小，3 组间差异极显著。对照组、2 h 运输处理组和6 h 运输处理组上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量依次增加，3 组间差异极显著；与对照组相比，2 个运输处理组肥大细胞数量均极显著增加，但2 个运输处理组之间差异不显著。

2.3 运输应激对山羊回肠黏膜结构及其免疫相关细胞数量的影响 由图3、表1 可知，运输处理组绒毛高度与对照组相比变化均不显著，但2 h 运输处理组显著大于6 h运输处理组；与对照组相比，2 h 运输处理组隐窝深度极显著增大，6 h 运输处理组隐窝深度显著减小；与对照组相比，2 h 运输处理组绒腺比极显著减小，6 h 运输处理组极显著增大。对照组、2h 和6h 运输处理组上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量依次增加，3 组间差异极显著；与对照组相比，2 个运输处理组肥大细胞数量均极显著升高，其中6 h 运输处理组显著低于2h 运输处理组。

表1 山羊小肠黏膜结构及其免疫相关细胞检测结果

3 讨 论

小肠是营养物质吸收的主要场所，正常的小肠形态结构是保证机体充分消化吸收营养物质的基础。小肠绒毛是小肠黏膜的主要结构，是动物营养物质消化吸收的特有结构，因此小肠绒毛高度和绒腺比是评价小肠发育和消化吸收功能的重要指标[12-13]。肠绒毛高时，成熟的绒毛细胞多，营养物质吸收能力强；肠隐窝深度体现了肠腺细胞的生成率，隐窝变浅，说明细胞成熟率升高，分泌能力强[14]。因此，当绒腺比增大时，小肠绒毛吸收营养物质的能力增强，反则亦然[15-16]。本研究结果表明，除6 h 运输处理组山羊回肠绒腺比极显著大于对照组外，2 个运输处理组山羊其他各肠段绒腺比均极显著小于对照组；除2 h 运输处理组空肠及6 h 运输处理组回肠外，与对照组相比，运输处理组山羊其他各肠段肠隐窝深度均极显著增加；运输处理组山羊各肠段肠绒毛高度与对照组相比也均有一定变化。这些变化说明运输应激对山羊小肠黏膜结构造成了一定的损伤，使小肠的消化吸收能力下降。多项研究表明，肉牛经长途运输后，体重均有一定的降低，运输后约2 周才逐渐恢复至运输前状态[17-18]，这也佐证了运输应激使小肠黏膜结构发生变化，导致小肠消化吸收营养物质的能力降低，最后可能间接引起动物体重下降。

图1 各组山羊十二指肠淋巴细胞、杯状细胞和肥大细胞（400×）

图2 各组山羊空肠淋巴细胞、杯状细胞和肥大细胞（400×）

图3 各组山羊回肠淋巴细胞、杯状细胞和肥大细胞（400×）

小肠黏膜不仅具有吸收营养物质的功能，还能应对致病性抗原入侵和不良因素刺激，进而使机体保持内环境的相对稳定，维持机体正常生命活动的免疫屏障功能[19-21]。小肠黏膜免疫系统由分布在小肠黏膜内的淋巴组织和免疫活性细胞共同组成，构成了抵抗病原体入侵的第一道免疫屏障，黏膜的免疫状况是小肠能否抵抗外来病原感染和入侵的关键因素。小肠黏膜内免疫活性细胞的数量和分布情况与小肠黏膜的免疫状况密切相关[22]。小肠黏膜上皮内淋巴细胞是小肠黏膜免疫系统的效应部分之一[23-24]，也是机体小肠黏膜免疫系统中和外来抗原及微生物接触最早的免疫细胞。因此，小肠黏膜上皮内淋巴细胞的数量和分布情况可以较好地反映小肠局部黏膜的免疫状况。本研究结果表明，运输处理组山羊各肠段肠绒毛上皮内淋巴细胞数较对照组均极显著增加，提示运输应激对山羊小肠黏膜免疫系统有较强的免疫激活作用，使其发生免疫反应，以此抵抗运输应激时细菌、病毒以及寄生虫等的侵袭[23]。

杯状细胞是专门合成、分泌黏蛋白的分泌型肠上皮细胞，其分泌的黏蛋白与水和无机盐等共同构成覆盖于肠道表面的黏液系统[25-27]。黏液系统在肠黏膜上皮表面形成屏障，对上皮有保护和润滑的作用，同时对食物消化率的提高较为重要[8]。还有研究认为，在尚未建立起被动免疫的初生动物的肠道免疫中，杯状细胞起着更为重要的防御作用[28]。杯状细胞曾被认为只是一种单纯的分泌细胞[29]，但最近有研究观察到，杯状细胞可以通过形成杯状细胞相关抗原通道将抗原转移到固有层内的抗原递呈细胞[30]。本研究表明，运输处理组山羊各肠段肠绒毛上皮内杯状细胞数较对照组均极显著增加，提示运输应激一定程度上损伤了山羊小肠黏膜，导致机体可能通过增加小肠绒毛内杯状细胞数量及其分泌黏蛋白含量，来抵御病原微生物的侵袭以及有害物质对小肠上皮的损害。

肥大细胞通过其分泌的细胞因子和炎症介质不仅能介导速发型变态反应，还在先天性免疫以及获得性免疫中起着重要作用。研究表明，肥大细胞能通过表达CD40、CD40L 促进抗原递呈细胞、T 细胞、B 细胞的活化，还能通过表达和分泌一系列免疫相关分子、细胞因子发挥免疫调节等作用[31]。本研究结果显示，运输处理组山羊各肠段肠绒毛肥大细胞数相比于对照组均有极显著增加，提示在运输应激条件下肥大细胞被激活，可能发挥一定的免疫调节作用。

4 结 论

本研究发现，短时间和长时间的运输应激均对山羊小肠黏膜结构造成了较大损伤，且运输后山羊小肠上皮内淋巴细胞、杯状细胞和肥大细胞数量显著增加，表明运输应激显著影响了山羊小肠的局部免疫状态，小肠黏膜免疫系统被激活，从而发挥免疫调节和免疫屏障作用。