韦懿宸，冯振博

（广西医科大学，广西 南宁）

0 引言

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是我国高发的恶性肿瘤之一，尤其在两广（广东、广西）地区。据广西新闻网发布的数据显示，HCC 是除肺癌外广西人口中最高发的恶性肿瘤。HCC 的发生发展是一个多阶段多因素积累连续复杂的过程。我国 HCC 的主要病因是乙肝病毒感染及黄曲霉毒素的摄入。目前推荐的治疗手段仍以包括病灶切除以及肝移植在内的手术治疗为主[1]。但因其发病隐匿，大多数患者发现时已为中晚期，临床治疗困难，手术切除率低，分子靶向治疗正逐步成为肿瘤精准治疗的新途径。MicroRNAs （miRNAs）是一类存在于动植物体内的，其长度为22 个nt 左右，内源性非编码单链小分子RNA，通过碱基对到信息的非翻译区（UTRs）的部分互补位点，在mRNA 的翻译和降解调控中发挥重要作用[2]。前期已有文献报道了miR-1303在食管癌[3]、胃癌[4]、结肠癌[5]中的促癌作用，但miR1303 在肝癌中的作用及机制尚未见报道。因此本研究通过检索筛选公共数据库中肝癌及相应癌旁组织miRNA 的芯片表达谱及高通量测序集，对miR1303 的数据进行荟萃分析；利用3 种miRNA 靶基因预测网站获得miRNA1303 的靶基因，并取交集，对重叠的靶基因进行功能富集分析，初步探讨这些靶基因在肝细胞癌中的表达，为miRNA1303 在肝细胞癌中的调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 公共数据库肝细胞癌相关数据集的筛选、提取和分析。

MiR1303 在肝细胞癌和癌旁表达谱数据来源为基因芯片表 达 谱 公 共 数 据 库（Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）检 索 式：（microRNA OR miRNA）AND （Hepatocellular Carcinoma OR HCC） 及TCGA，The Cancer Genome Atlas Program，（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）。数据筛选纳入标准：（1）组织来源为人；（2）组织为原发性肝细胞癌，术前为接受放化疗及免疫治疗，或未接受任何药物化学处理的人肝细胞癌细胞系及正常人肝细胞系；（3）需包含miRNA1303 表达数据；（4）肝细胞癌或非癌样本例数≥3。数据提取包括第一作者、发表年份、国家、数据源、检测方法或平台、miR1303 的表达值、癌症组和对照组的样本量。

1.2 miRNA 靶基因预测及功能富集分析

我们使用miRDB（http：//www.mirdb.org/）、TargetScan Release 7.1（http：//www.targetscan.org/vert_71/）、miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）预测miR1303 的靶基因，并对获得的三组靶基因集取交集。然后用Metascape（http：//metascape.org/gp/index.htmL#/main/step1）对靶基因进行功能富集分析、蛋白互做分析及基因注释分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差表示，miRNA1303 在肝细胞癌和非癌组织或细胞的表达比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。使用作图软件GraphPad Prism 7 制作GEO和TCGA 数据库单个数据集散点图；采用软件Stata 12.0 合并GEO 和TCGA 数据库中miR1303 表达值，计算标准化均差SMD 并制作森林图，分析异质性和敏感性，计算sROC 曲线评估miR1303 诊断价值。

2 结果

2.1 公共数据库基因芯片汇总

符合纳入标准的6 组GEO 芯片和1 组TCGA 相关数据见表1。肝细胞癌样本342 例，非癌组织样本113 例。

2.2 公共数据库中miR1303 在单个数据集中的表达水平

通过挖掘公共数据库GEO 和TCGA，共筛选得到7 组数据集，这些数据集提供了miR1303 在肝细胞癌和非癌组织中的表达量。对单个独立数据集进行miR1303 表达量分析，结果显示miR1303在多数数据集中肝细胞癌组织中相对高表达。见图1。

2.3 公共数据库数据Meta 分析

由于每个研究数据集中样本量有差别，本研究整合了所有GEO 基因芯片和TCGA 中miR1303 的表达值，并进行Meta 分析。结果显示7 组数据集之间的异质性较大（I2=71.1%，P=0.002），选用随机效应模型。MiR1303 的合并标准均差SMD 为0.53（95%CI：-0.06，1.12）图2A.表明miR1303 在肝细胞癌组织中明显上调。漏斗图显示miR1303 在肝细胞癌中的表达没有发表偏倚，图2B。sROC 曲线曲面下面积为0.79（95%CI：0.75，0.82）有较好的诊断价值，图2C。

2.4 miR1303 靶基因预测及其功能富集分析、蛋白互做结果

图1 公共数据库分析miR1303 在肝细胞癌组织与非癌组织中的表达水平

表1 公共数据库中miR1303 在肝细胞癌和非癌组织的表达数据汇总

使用miRDB、TargetScan Release 7.1、miRWalk 预测miR1303靶基因，分别得到3464、7900、810 个靶基因，取交集之后得到233个靶基因，如图3A 所示。之后使用Metascape 对这233 个目标基因进行基因注释、功能富集分析，结果如图3B。PPI 蛋白互做网络筛选出5 个枢纽基因，分别为RGPD4、RGPD8、NUP133、RGPD5、ERLIN2，结果如图3C。

3 讨论

原发性肝癌按照来源组织病理学分为肝细胞型，胆管细胞型和混合细胞型。其中肝细胞癌是世界上最常见的几种恶性肿瘤之一，每年有近78 万新发肝细胞癌病人同时有约75 万肝细胞癌病人其中将近一半的肝细胞癌病人是发生在中国[6,7]。迄今为止，手术切除和肝脏移植仍然是肝癌治疗最主要的手段。但是由于肝癌缺乏早期的诊断手段，90%的病人在确诊时已经处于肝癌中、晚期，此时手术切除治疗的患者术后有高复发转移率，这严重影响患者的治疗效果，带来不良预后。因此，肝癌的早期发现并及早干预，将大大改善肝癌的治疗效果和预后。

图2 miR1303 在公共数据库中的表达meta 分析结果

图3 miRNA1303 靶基因预测及其功能富集、蛋白互做结果

目前认为肝癌的发生发展是由内外环境因素引起的癌基因激活、抑癌基因失活的多因素，多基因共同参与的复杂的病理过程[8]。miRNA 作为重要的基因调控分子，与肿瘤有着密切的关系。截至日前已经有很多的miRNA 被报道，在癌症发生过程中表达发生变化，而且其变化会引起下游靶基因的含量改变，进而影响肿瘤进展[9]。MicroRNA 在疾病的诊断、治疗、预后判断等有着一定价值。如Chen 等[10]发现了由十种miRNA 组成的非小细胞肺癌诊断标准；Jin 等[11]发现，肝癌治疗中，通过提高肝细胞miR-26 含量，降低下游靶基因ULK1 的表达，进而增强肝细胞对化疗药物Dox 的敏感性；胃癌患者中，血清中高含量的miR-451、miR-16 有着更高的总体生存率[12]。

我们通过数据挖掘miR1303 的表达量，并用meta 分析的方法进行合并，发现其在肝细胞癌中相对于正常肝组织具有更高的表达水平，提示其可能是一个促癌因子。同时合并的sROC 曲面下面积达到0.79，具有较好的诊断肝细胞癌的价值。另外我们预测了miR1303 的潜在靶基因，发现这些基因功能上有：携带核定位信号（NLS）的蛋白质从细胞质到核膜的定向运动、调节细胞蛋白定位、细胞分化负调控、胞质运输、肿瘤细胞反应、免疫球蛋白分泌、细胞微管骨架结构的蛋白定位、肌发生、FGFR1 突变受体激活、膜运输、脾发育、蛋白质泛素化、活性氧代谢过程、突触后膜组织、类泛素化修饰；有关的通路有RIG-I 样受体信号通路 、细胞因子介导的信号通路、激素介导的信号通路、神经营养蛋白介导的信号通路、经典Wnt 信号通路的负调控，见图3B。通过蛋白互做网络分析得到RGPD4、RGPD8、NUP133、RGPD5、ERLIN2 这5 个枢纽基因，提示miR1303 可能通过结合这些靶基因在肝细胞癌的病理过程中发挥作用。