孙亮 周旋 刘桂治 林茂锐 李明友 曹东林

原发性肝癌是全球男性癌症死亡的主要原因之一，肠道微生态是一个包含着大量肠道微生物的复杂生态系统，其可以通过肝-肠循环参与到肝癌的致病过程中[1-3]。动物研究发现，肠道微生物菌群紊乱与肝癌关系密切[4-6]。本研究探索了原发性肝癌患者肠道菌群结构的变化，现报道如下。

资料与方法

一、病例资料

选择2017年9月至2018年12月广东省第二人民医院诊疗的原发性肝癌患者87例，其中男55例，女32例，年龄32～71岁，平均(58.3±8.7)岁。入选标准：病理确诊为原发性肝癌患者。排除标准：伴发其他脏器原发性恶性肿瘤者，曾使用过放化疗、生物或者免疫治疗者，入组1个月前曾使用过益生菌者，伴发急慢性胃肠道感染性或免疫异常疾病者。另取健康体检者80名作为对照，其中男52名，女28名，年龄30～72岁，平均(58.1±8.7)岁。原发性肝癌与健康对照组在性别和年龄组成方面具有可比性，差异无统计学意义(P>0.05)。

二、微生物基因组DNA制备

无菌环境下收集入组患者中段粪便，使用粪便基因组DNA 快速提取试剂盒(购自北京艾德莱生物科技有限公司)，按照说明书提取总DNA。通用引物扩增16S rDNA V3-V4区，引物由深圳华大基因设计合成，引物序列16S rDNA:上游引物 5′-CCTACGG-GAGGCAGCAG -3′，V3-V4区:下游引物 5′-ACGA-GCTGACGACARCCATG -3′。扩增条件：94 ℃预变性4 min；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR试剂盒购自大连宝生物公司，1%琼脂糖凝胶电泳PCR扩增样品后，紫外灯下切胶回收PCR扩增产物，使用DNA 凝胶回收试剂盒(美国基因公司产品)纯化PCR扩增产物，通过Illumina平台进行高通量测序(天津生物芯片技术有限责任公司)。

三、测序数据分析

将测序数据输入开源微生物种群分析软件包QIIME，运行工作流pick_de_novo_otus.py脚本程序，作α多样性分析，然后以 97%以上相似度的标准聚类成一类OUT，比对OTU代表序列，对每个OTU进行物种分类，构建系统发育树，总结OTU信息，总结分类组成的群落。通过Anosim相似性分析对比原发性肝癌患者和对照组间微生物菌群的差异。

四、统计学方法

结 果

一、原发性肝癌组和健康对照组间α多样性

α多样性中的Chao1 指数、Simpson指数、Shannon指数和 Gini指数在原发性肝癌组和健康对照组间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 原发性肝癌组和健康对照组间α多样性的比较

二、原发性肝癌组和健康对照组门水平菌群结构

肝癌组拟杆菌门和变形菌门所占百分比显著高于健康对照组。肝癌组厚壁菌门和放线菌门所占百分比显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 原发性肝癌组和健康对照组门水平菌群结构的比较(%，±s)

三、原发性肝癌组和健康对照组属水平菌群结构

肝癌组拟杆菌属和大肠杆菌螺旋杆菌属所占百分比显著高于健康对照组(P<0.01)。肝癌组双歧杆菌属和梭菌属所占百分比显著低于对照组(P<0.01)。见表3。

表3 原发性肝癌组和健康对照组属水平菌群结构的比较(%，±s)

讨 论

定植于人体胃肠道的细菌参与了各系统器官多种疾病的发病过程，肝-肠循环使肠道菌群和肝脏之间联系起来[7, 8]。细菌培养是菌群鉴定的主要方法，但目前只有30%的肠道菌群可以培养，随着分子生物学技术的进步，特别是Illumina 公司推出的 Hi Seq 高通量测序系统为肠道菌群的基因组学研究提供了方便[9-11]。本研究使用第二代高通量测序技术检测发现原发性肝癌组和健康对照组间反应α多样性的Chao1 指数、Simpson指数、Shannon指数和 Gini指数差异无统计学意义，说明了两组间肠道微生态的物种多样性或丰度方面无显著性差异。

门属分析显示，肝癌组拟杆菌门和变形菌门比例显著高于对照组，而厚壁菌门和放线菌门所占比例显著低于对照组，以及拟杆菌门中的拟杆菌属和变形菌门中的大肠杆菌螺旋杆菌属比例显著高于对照组，放线菌门中的双歧杆菌属和厚壁菌门中的梭菌属著低于对照组。上述结果说明了肝癌患者肠道微生物系统中菌群主要以拟杆菌属和大肠杆菌螺旋杆菌属为主，拟杆菌属具有特殊鞘脂结构，代谢中鞘脂失衡可导致细胞周期的紊乱，大肠杆菌螺旋杆菌属过生长，可抑制双歧杆菌、乳杆菌等潜在有益菌的生长繁殖[12-17]。本研究结果显示，肝癌患者中双歧杆菌属比例的降低，梭菌属中的乳杆菌和肠球菌对机体是有益的，而且有利于黄曲霉毒素的降解[18-20]。调控这种菌群的失衡是否有利于肝癌的临床疗效改善有待进一步的研究。

综上所述，肝癌患者肠道微生态系统中拟杆菌属以及其隶属的拟杆菌门，大肠杆菌螺旋杆菌属以及其隶属的变形菌门所占比例明显著高于对照组，双歧杆菌属以及其隶属的放线菌门和梭菌属以及其隶属的厚壁菌门所占比例明显著低于对照组，调节这种肠道微生态系菌落的平衡可能是辅助治疗肝癌的新靶点。