林以琳,邱建清,李世洋,曾绍校,林少玲

(福建农林大学食品科学学院,福建福州 350000)

核黄素是人体必需的维生素,具有一定的荧光性及光敏特性。近年来,核黄素作为人体生命活动不可缺少的维生素,对改善生物体的新陈代谢以及促进人体的生长发育发挥着重要的作用。但核黄素作为一类重要光敏剂[1],在光生物学上具有一定的光动力治疗特性。据报道,核黄素是异四氧嘧啶环激发产生的一种光敏剂,当氧化剂存在时,核黄素被氧化且在492～495 nm或517～527 nm的激发光发射范围内可以检测到荧光。核黄素光敏特性在治疗肿瘤癌症等疾病中已得到充分的应用,且作用效果显著。

目前,应用较为广泛的光敏剂主要有姜黄素、亚甲基蓝、血啉甲醚等。光敏剂作为光动力技术的核心要素,参与光动力反应的全过程。因此,开发天然、有效、具有营养价值的光敏剂对于光动力技术的突破具有重大研究价值。光动力技术作为一种新型的治疗手段,能够有效地作用于目标物,且不损伤邻近组织,在肿瘤与癌症的治疗当中已得到广泛的关注。相较于传统的放疗、化疗方式,光动力技术具有高效、安全、经济环保等特点[2-3]。核黄素是一类新型的具有营养价值的光敏剂,已被应用于肿瘤癌症、植物病虫害及生物体中病毒和有害微生物的控制。

因此,本文综述了核黄素作为光敏剂的光动力技术的研究进展,总结了核黄素介导的光动力技术在治疗疾病、病虫害以及生物体中发挥的应用,并就其对人体健康的影响进行总结,为将其进一步应用于食品安全领域提供参考。

表1 核黄素的功能Table 1 Functions of riboflavin

1 核黄素的生理功能及光学特性

1899年,英国化学家Wynter Blyth在牛奶中提取出一种亮黄色的色素,并将其命名为乳黄素,即核黄素[4]。核黄素作为水溶性B族维生素,微溶于水,呈强黄绿色荧光,其化学结构如图1所示。核黄素主要由黄素单核苷酸(FMN)和黄素鸟嘌呤二核苷酸(FAD)两种重要成分组成,参与机体复杂氧化反应。如表1所示,核黄素具有利尿、降血脂和改善心脏功能的作用,是生物体生命活动中必不可少的维生素[5],其生理功能主要包括:核黄素作为线粒体能量代谢的参与者,不仅可以改善其能量代谢,还可以作为自由基清除剂,清除脂质过氧化产生的自由基对线粒体功能的损害,从而对线粒体起到保护作用;在机体中具有递氢的作用且具有极强的氧化能力[6],在铁-硫簇(Fe-S)物质存在时可生成超氧负离子自由基,在光敏化后可进一步转化为羟基自由基[7-10],对于氧活性物质的产生具有重要的作用等。因其具有广泛的生理功能,现已被世界卫生组织作为评估人体身体与营养代谢状况的指标之一[11]。

图1 核黄素的化学结构Fig.1 Chemical structure of riboflavin

核黄素主要存在于蔬菜和动物的食物中,是多种氧化还原酶的辅酶,具有抗炎、抑癌和抗氧化等作用,热稳定性强,对光极其敏感[15]。核黄素在强碱或可见光、紫外线下时不稳定,光照及紫外照射会引起核黄素不可逆的分解[16]。在337 nm激光作用下,核黄素仅产生三重激发态;而在248 nm激光作用下,可产生三重态激发和氧化型自由基,导致细胞衰老甚至死亡,因此核黄素是一种有效的光敏剂[17]。已有研究发现,核黄素经酯化作用可产生2′,3′,4′,5′-四乙酸核黄素,其具有延长寿命、保持良好的光敏特性的特点[18]。此外,研究表明核黄素可以结合微生物中的核酸,阻碍核酸的复制从而发挥光敏作用[19]。

2 核黄素介导的光动力技术

2.1 光动力技术的概述

光动力技术(PNST)指光源与光敏剂相互作用产生活性氧物质(ROS),杀死有害物质的新型冷杀菌方法。通过氧、光敏剂和可见光几个基本要素之间的相互作用生成ROS,利用氧化作用破坏生物靶分子的结构,当破坏程度超过一定阈值,生物靶分子则会发生氧化损伤,导致细胞死亡[20]。近年来,光动力技术作为一种非手术代替疗法在治疗恶性肿瘤中已得到广泛应用[21],成为治疗癌前病变或皮肤肿瘤的常规方法;光动力技术有效地灭活单增李斯特菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等致病菌,保障了食品安全。

按光敏剂本身性质可分为:内源性光敏剂(5-拟氨基酮戊酸等)和外源性光敏剂(即第二代光敏剂)。按光敏剂的一般分类方法可分为:第一代光敏剂(血卟啉衍生物的混合剂)、第二代光敏剂(卟啉类衍生物)和第三代光敏剂(卟啉类衍生物与生物学特性的物质结合)。其中,第三代光敏剂处于研制阶段,其改善了常规光敏剂的缺陷、提高靶向性,具有特异性识别功能[22],如酞菁类物质及Npe6等,具有良好的发展前景[23]。

2.2 核黄素介导光动力技术的作用机理

核黄素作为一类具有营养价值的光敏剂[24],其介导的光动力作用机理,如图2所示:在光照条件下,基态(S0)核黄素吸收光能量生成寿命极短的单线态激发态(S1)后跃迁至三重激发态(T1)。在水环境中,通过光照的核黄素可产生大量的活性氧,如:1O2、O2·-和·OH。此时,大量的活性氧与三重激发态核黄素(T1)发生氧化作用,导致有害物质的结构及功能发生改变,从而破坏有害物质的正常生理活性,导致其死亡。在反应停止后,核黄素可从三重激发态(T1)直接恢复至稳定的激态,而不会降解[25-27]。

图2 核黄素介导的光动力作用机理Fig.2 Mechanism of photodynamictechnology mediated by riboflavin

2.3 核黄素光敏剂介导的光动力技术的应用

2.3.1 在肿瘤治疗中的应用 肿瘤癌症的治疗主要包括射线放疗、全身热疗、基因疗法。Long等[28]通过培养有无缺失核黄素的HEK293T和NIH3T3细胞,并观察细胞的增殖状态,研究发现缺乏核黄素致使NIH3T3和HEK293T细胞的肿瘤发生率增强2倍。此外,与正常HEK293T细胞相比,小鼠的致瘤性增强。Tutino等[29]采用聚合酶链反应(PCR)和Western blotting方法检测人体结肠癌细胞和大肠癌患者组织中的基因及蛋白表达水平,结果表明核黄素促进了直肠癌细胞(CRC)的表达,减少了RFVTs 转运蛋白的表达,以上发现为核黄素介导光动力技术治疗肿瘤奠定基础。

皮肤癌是一种恶性肿瘤,通常发生于皮肤的暴露部位,如手臂、面部、头部等,对患者的生活造成了较大的困扰,其发病机制包括皮肤免疫系统的损伤、关键酶的诱导、细胞周期的延长等[30]。20世纪主要以维A酸、异维A酸或紫外线对皮肤病进行治疗,其疗效相对稳定,但其必须作用于早期阶段的病患,不能根治皮肤病[31]。21世纪,核黄素作为光敏剂的光动力疗法掀起了热潮,其结合了早期治疗皮肤病的方法,能够从根本上解决皮肤病带来的问题,效果显著[32]。Miller等[33]将近红外荧光分子探针与荧光分子成像结合对皮肤鳞状细胞癌(SCC)进行实验,结果表明,内源性荧光核黄素作为一种荧光探针对皮肤鳞状细胞癌进行监测的同时,还有效降低了癌细胞活力。Salman等[34]采用顺铂、核黄素与光照联合的方法治疗小鼠皮肤瘤,研究发现,光照下核黄素的抗增殖作用显著增强,可诱导皮肤癌细胞凋亡,有效降低了正常细胞的坏死,且治疗的效果较好。由此表明,核黄素作为一种光敏剂对于皮肤癌的治疗具有重要的意义。

2.3.2 在眼部疾病中的应用 眼睛是人类重要的器官,但眼病的快速发展已严重困扰人类的正常生活。世界卫生组织曾统计:至2020年,全球因眼病造成的失明人数将多达7600万人[35]。目前,治疗眼病的方法主要有:激素疗法、放射疗法或手术疗法,但其对于机体本身造成了潜在的损伤[36]。目前,Foschini等基于核黄素介导的光动力技术原理发明了一种治疗圆锥角膜的核黄素离子导入装置,将装置安放于待治疗的眼睛上,施加0.5～5 min的阴极电流,在紫外光下辐照5～30 min,从而获得核黄素的角膜交联,此方法为眼病的治疗提供新的有效手段[37]。此外,Lombardo等[38]发明了一种基于核黄素与紫外线的光动力技术角膜治疗的无创光学方法,研究发现,基质内核黄素浓度及其紫外线照射角膜中的核黄素消耗量与治疗所致基质硬化效应呈极显著正相关。Hagem等[39]利用甲基纤维素与核黄素常规照射和紫外线照射(UVA)下眼角膜胶原交联(CXL),研究发现,两年后患者眼睛的视力得到改善,且使用核黄素与甲基纤维素可减少照射时间,加速CXL的治疗。

2.3.3 在病虫害领域的应用 核黄素介导的光动力技术在植物水平上已被用于研究棉蚜的致死情况。经研究发现,光照可促使棉蚜产生核黄素,内源性核黄素与光的相互作用产生的活性氧可引起细胞DNA氧化损伤,但外源核黄素对DNA具有一定的保护作用[40]。因此,过量表达的核黄素会累积DNA损伤,进一步引起细胞内促红细胞生成素的积累,导致棉蚜死亡。此外,研究表明,植物不仅可以通过自身的生长代谢产生核黄素,还能经体外注射核黄素来防止植物病虫害、促进植物生长[41],如邓晟[42]在ParA1蛋白对烟草抗病性的研究中发现,只有在光源照射下的ParA1蛋白对细胞的诱导作用受到核黄素的抑制,而且这种抑制完全阻断了过敏反应的进行,其可能通过活性氧产生的羟自由基的负调控过程,核黄素的含量在抑制过敏反应过程中发生了明显的变化。同时,丁锦平等[43]在研究抑制棉花枯萎病菌生长时发现,当核黄素的浓度大于0.5 mg/mL,能显著的抑制不同阶段棉花枯萎菌丝的生长,以期为植物病虫害的防治提供一定的参考价值。

2.3.4 在其他生物体中的应用 在波长为320～400 nm的广谱近紫外线照射下,核黄素有效降低高等真核生物菌株(如真菌、动物细胞等)的存活率,并且随着浓度的提高,其存活率相应下降[44]。在类似的光谱仪中,核黄素处理的小鼠胚胎纤维细胞的DNA损伤比空白组更严重;同时,与空白组对照,荧光灯照射对小鼠糖尿病的胚胎纤维细胞DNA损伤更严重[45]。王志勇等[46]在探讨核黄素介导的光动力技术对病毒的灭活过程中也发现了类似现象,在紫外灯照射下,300 μmol/L核黄素作用10 min就可将水泡性口腔炎病毒杀死。因此,核黄素作为光敏剂在对病毒杀伤的同时,对动物细胞可能也会产生一定的损伤。此外核黄素对于某些酶类物质的生理功能也存在一定的影响[47],张兆霞等[48]利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳研究核黄素对溶菌酶的影响,发现在可见光波段下的核黄素对溶菌酶造成不可修复性损伤,经对SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的产物进行分析,结果表明:可见光的光照时间、核黄素的浓度等条件因素与溶菌酶的损伤呈现正相关关系,其作用机制符合光敏损伤机制。

2.3.5 核黄素降解产物介导的光动力技术的应用 核黄素的降解产物比核黄素本身稳定,且核黄素的降解产物2′,3′,4′,5′-四乙酸核黄素(2′,3′,4′,5′-tetraacetylriboflavin(RTA))介导的光动力技术在降解有毒有害物质中也发挥了极大的作用。罗沙砷是一种典型的有机砷饲料添加剂,用于治疗肠道寄生虫,可提高饲料的品质,但罗沙砷的自然界降解率低,降解产物具有毒性。因此,Meng等[49]以RTA为光敏剂,进行光催化降解硝羟苯胂酸,经90 min光照后,硝羟苯胂酸降解为As(III),进而氧化为As(V),达到降解的目的。但迄今为止,RTA作为光敏剂介导的光动力技术的研究报道还较少,其有效性和安全性仍需进一步探究。

2.4 核黄素对食品品质的影响

核黄素作为维生素的重要组成部分,其存在于动物内脏、奶类、蛋类、豆制品、蔬菜中。迄今为止,核黄素的多数研究还停滞于其营养价值的利用、维持其营养素不遭受破坏等[50-51]。Boyaci等[52]通过挤压技术研究玉米营养素的破坏程度,结果表明核黄素的损耗量与温度、含水量有关;因此,降低温度或适量注射二氧化碳有利于保持微量营养素的结构,获得品质较优良的玉米。此外,Jung等[53]采用分光光度计法研究核黄素介导的光动力技术检测饮料中抗坏血酸含量,结果表明在核黄素和光照下,抗坏血酸的氧化速度极快,相较于高效液相色谱法,核黄素介导的光动力技术具有更高的准确度。到目前为止,核黄素作为光敏剂的光动力在食品安全领域的应用报道较少见。因此,基于核黄素的功能与研究背景,有望通过核黄素介导的光动力技术应用于食品安全领域,进而加强食品的安全性。

3 核黄素介导的光动力技术对人体健康及食品的影响

3.1 对人体健康的影响

叶酸是一种有效的核黄素光敏剂,抗氧化剂和α-叶酸含量控制着人体的衰老状态[54]。据统计,人体每日所需的维生素B2较稳定(1～2 mg),人体在正常状态下的核黄素含量就会引起光敏反应(8 mmol/kg),且叶酸对光照尤为敏感[55]。已有研究表明皮肤暴露在阳光下,可促使体内核黄素发生化学反应,形成不同程度的激发态,通过电子转移与嘌呤碱基作用(鸟嘌呤和腺嘌呤的反应),导致人体部分细胞的DNA损伤,增加皮肤癌的发病率[56]。研究发现,通过内滤作用的类胡萝卜素可预防核黄素的光敏反应对人体造成的损伤[57]。因此,当高强度的阳光照射时,可通过摄入适量的类胡萝卜素来预防叶酸的光氧化从而降低人体的损伤,预防衰老。

在高度工业化发展的今天,眼病如:白内障、老年性黄斑变性(AMD)等是老年人群中日益增长的疾病。其病理与光化学反应历程存在直接关联[58]。过去研究认为,黄色素具有改善视力和防止紫外线激发的功能[59]。Tomany等[60]通过光动力技术,研究牛眼球晶状体的蛋白病变中发现:核黄素与晶体蛋白的结合参与了光敏反应过程。在晶状体中,色氨酸的氧化产物作为紫外线滤光器,对牛眼球具有保护作用。核黄素在治疗眼病时可激活蛋白质的氧化活性,因此在光动力技术治疗基础眼角膜交联手术中发挥主要作用[61]。从流行病学的角度来看,拖延治疗眼病会导致老年人视力极速下降,甚至具有失明的可能性。研究表明,吸烟会增加体液中核黄素的浓度,是AMD发展的主要原因[62];类胡萝卜素的摄入会大幅度的降低患AMD的风险;某些类黄酮似乎也具有保护视网膜色素上皮细胞免受氧化应激诱导的能力[63];大量摄入鱼类也可以预防AMD的发生,其根本原因是一种长链U-3脂肪酸的有效调控[64]。因此,建议老年人群通过适当增加鱼类和海产品以及富含类胡萝卜素和类黄酮的水果和蔬菜的摄入来降低患AMD的风险。

3.2 对食品稳定性的影响

核黄素大量存在于肉类制品、乳制品和啤酒中,且对其品质都具有实际生物意义。Frederiksen等[64]对光照下的肉制品进行探究,发现在高氧包装冷藏期间,高密度氧的环境可保持牛肉和猪肉的新鲜程度,以减少微生物的生长,用来维持肌红蛋白鲜艳的红色。但随着贮藏时间的延长,肉质很快出现松软现象,研究表明这种现象与核黄素的作用息息相关,高氧条件(80%)有利于核黄素发生光氧化,从而引起肉制品发生松软现在,导致肉制品品质下降。Sattar等[65]对自然光照射下的乳制品进行感官评价,发现经自然光照射后,乳制品产生类似“纸板”或者“烧焦的羽毛”的味道;经过分析,乳制品内部发生了化学反应,促使牛奶的感官品质发生变化,这归因于牛奶中的天然物质核黄素所致[66]。光照射下的啤酒也曾出现过类似变味的现象[41]。啤酒因含有核黄素,而具有强的光敏特性,光照后会产生一种类似于肛门腺排出的气味,称为“臭鼬”。研究表明,啤酒花中的苦味也是由核黄素所致[67]。

4 结论与展望

核黄素来源广泛、价格低廉。近年来,核黄素作为药物在医学上的应用实例日益增多,诸多研究已证实核黄素作为光敏剂在肿瘤、癌细胞、病虫害等领域的应用情况,为今后核黄素的大量开发和应用于食品冷杀菌领域提供了良好的研究基础。然而,大量研究显示,核黄素的光敏感性对人体健康和食品稳定性具有潜在的影响,大量的摄取或者摄取不足均会导致一些疾病的出现以及对食品品质的影响。因此,本文综述了核黄素介导的光动力技术的研究进展,表明其具有良好的研究基础和在食品冷杀菌技术领域的应用前景。此外,考虑到其可能存在的对人体健康的影响,在光动力技术的应用中,合理控制核黄素的使用量和光照强度是该技术需重点关注方向。