林 贺 ，刘玥欣 ，任吉祥 ，兰天野 ，王晋冀 ，徐 岩 ，许佳明 ，律广富 ，叶豆丹 ，黄晓巍

（1.长春中医药大学，长春130117；2.长春中医药大学附属医院，长春130021）

轻度认知功能障碍（MCI）是正常脑老化发展为阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）过渡状态，由于AD是不可逆转的，因此对MCI进行研究，提早进行干预，对于降低AD的发病率具有重要意义[1]。冈田酸（OA）是磷酸酯酶抑制剂，能够引起全局化的磷酸化水平提高，常用于体外MCI模型的制备[2～3]。鹿茸多肽是鹿茸的主要药效物质，能够催生神经元的生成和干细胞的分化，能够更快促进神经轴突的生长，对神经系统有滋养的作用[4]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（AKT）、半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）等是脑组织PI3K/AKT信号通路的重要信号因子，是鹿茸多肽通过PI3K/AKT信号通路治疗MCI的潜在靶点[5～6]。本实验通过OA诱导制备HT22细胞损伤模型，观察鹿茸多肽对受损细胞内 PI3K、AKT、Caspase-9表达的影响，探讨相关作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验试剂与仪器

鹿茸多肽，长春中医药大学制备（每1g含生药量28.7g）；OA，上海源叶生物科技有限公司，批号：S43785；MTT，上海旭东海普药业有限公司，批号：030405；PI3K、AKT ELISA试剂盒，上海仁捷生物有限公司， 批号：YY-02217M、FC-98532Q；PI3K、AKT、Caspase-9、GAPDH一抗、HRP二抗，武汉三鹰生物技术有限公司，批号：10176-2-AP、20584-1-AP、10380-1-AP、10494-1-AP、15134-1-AP； 全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光法检测试剂盒、彩虹245广谱蛋白Marker、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，北京索莱宝科技有限公司，批号：BC3711、PC0020、SW2010、PR1920、P1200-2；MCO-17型CO2孵箱，日本三洋公司，型号：EUI3748；倒置显微镜，日本 OLYMPUS 公司，型号：CHY4568；Multiskan FC酶标仪，美国Thermo公司；凝胶成像仪，英国UVItec公司，型号：Alliance Q9；电泳仪、电转仪、电泳槽，伯乐 bio-rad，型号：BE6085。

1.2 HT22细胞培养[7]

采用含10%FBS的DMEM/F12中培养HT22细胞，每3d更换50%新鲜培养液，于倒置显微镜下观察生长状态。培养2～4h后，HT22细胞逐渐贴壁伸展，形成轴突、树突相连的网状结构，培养7d至发育成熟。

1.3 HT22细胞损伤模型的建立[8]

选择生长状态良好、呈对数生长的HT22细胞，于5%CO2、37℃条件下，在孵箱中进行分组培养（细胞浓度为 1×106 个/ml，3ml/瓶）。 正常对照组给予DMEM/F12，DMSO对照组给予含 0.01%DMSO的DMEM/F12，OA细胞损伤模型组给予含10nmol/L OA的DMEM/F12，鹿茸多肽高、中、低剂量组给予含10nmol/L OA 的 鹿 茸 多 肽 （1000μg/ml、500μg/ml、50μg/ml），于 5%CO2、37℃条件下，孵箱培养 24h。

1.4 MTT法检测细胞存活率[9]

将HT22细胞接种在多聚赖氨酸包被过的96孔板上 （细胞浓度 1×105 个/ml，200μ/孔）， 于 5%CO2、37℃条件下，孵箱培养7d后，正常对照组给予DMEM/F12，DMSO对照组给予含 0.01%DMSO的DMEM/F12，OA细胞损伤模型组给予含10nmol/L OA的DMEM/F12，鹿茸多肽高、中、低剂量组给予含10nmol/L OA 的 鹿 茸 多 肽 （1000μg/ml、500μg/ml、50μg/ml），继续培养 24h。

加入 MTT 工作液（10μl/孔，MTT 浓度为 0.5g/L），培养 4h，弃掉 MTT 工作液后加入 DMSO（100μl/孔），待蓝色甲臜结晶完全溶解后，检测各组细胞A595/A635吸光值，计算细胞生存率。细胞生存率=（实验组吸光值/正常对照组吸光值）×100%。

1.5 ELISA检测受损HT22细胞PI3K、AKT含量

按照ELISA试剂盒说明方法操作，测定450nm波长处吸光度 （A）值，计算各组实验细胞中PI3K、AKT含量。

1.6 Western Blot检测受损 HT22细胞 PI3K、AKT、Caspase-9表达水平

按照全蛋白提取试剂盒说明方法提取细胞蛋白，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明方法测量蛋白含量，定量后放置于涡旋仪上摇匀，放入100℃水浴加热10min，放入-80℃储存。按照SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明方法制胶，电泳时浓缩胶电压90V，分离胶电压110V，电泳完成后，进行转模，转模条件为100v，60min。结束转模后，TBST洗5min，共3次，5%脱脂牛奶封闭 1h，一抗 TGF-β1（1∶3000）、SMAD7（1∶2000）、PKC（1∶4000），4℃过夜，TBST 洗 10min1 次，洗 5min2次。HRP二抗常温摇床孵育1h，TBST洗5min，共3次，超敏ECL化学发光检测试剂盒A、B液等比例混匀后显色。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0统计分析软件进行数据处理，计量资料均采用表示，多组均数组间比较采用单因素方差分析，显著性水准P＜0.05。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞存活率结果

细胞存活率检测结果说明，与正常对照组比较，OA细胞损伤模型组细胞存活率明显降低 （P＜0.05）；与OA细胞损伤模型组比较，鹿茸多肽高、中、低剂量组细胞存活率明显升高（P＜0.05），结果见表1。

表1 细胞存活率结果（，n=6）

2.2 ELISA检测各组实验细胞内PI3K、AKT含量结果

ELISA检测结果说明，与正常对照组比较，OA细胞损伤模型组细胞内PI3K、AKT含量明显降低 （P＜0.01或P＜0.001）；与OA细胞损伤模型组比较，鹿茸多肽高、中剂量组细胞内PI3K含量明显升高（P＜0.05或P＜0.01），鹿茸多肽高剂量组细胞内AKT含量明显升高（P＜0.05），结果见表 2。

表 2 PI3K、AKT 含量结果（，n=6）

2.3 Western Blot检测各组实验细胞内 PI3K、AKT、 Caspase-9表达水平结果

Western Blot检测结果表明，与正常对照组比较，OA细胞损伤模型组细胞内PI3K、AKT、Caspase-9表达水平明显降低（P＜0.01 或 P＜0.001）；与 OA 细胞损伤模型组比较，鹿茸多肽高剂量组细胞内PI3K表达水平明显升高（P＜0.05 或 P＜0.01），鹿茸多肽高、中剂量组细胞内AKT表达水平明显升高 （P＜0.05或P＜0.01），鹿茸多肽高剂量组细胞内Caspase-9表达水平明显升高（P＜0.05），详见表 3，图 1。

表 3 PI3K、AKT、Caspase-9 表达水平结果（，n=6）

图1 PI3K、AKT、Caspase-9表达水平电泳图

3 讨论

PI3K/AKT信号通路广泛存在于各种细胞中，是神经存活信号转导的主要途径之一，参与并调节细胞生长、增殖、分化与迁移，是经典的抗凋亡、促存活的信号转导通路，也是调节大脑认知功能的关键信号通路[10～11]。 研究表明，MCI患者因脑内 PI3K/AKT信号通路受到抑制，进而引发神经细胞凋亡，影响记忆功能。激活PI3K/AKT信号通路，能够抑制神经细胞凋亡，改善能量代谢，促进神经功能的恢复，具有明显的脑保护作用[12]。Caspase-9是Caspase蛋白家族中一种重要的促凋亡因子，抑制Caspase-9的表达水平可产生明显的神经保护作用[13]。本研究通过体外细胞实验发现通过OA诱导的受损小鼠海马神经元HT22细胞内PI3K、AKT表达水平明显下调，而鹿茸多肽各剂量组均出现改善，说明鹿茸多肽能够在一定程度上提高PI3K、AKT表达、抑制Caspase-9表达，减少神经细胞凋亡。本研究结果表明，鹿茸多肽对OA诱导的鼠海马神经元HT22细胞损伤模型具有保护作用，作用机制可能与调控受损细胞内表达水平有关。