李进鹏 梅 璐 王效聪 秦珍珍 张 晗 郑鹏远

(郑州大学第五附属医院消化内科，郑州大学马歇尔医学研究中心，郑州 450000)

在世界范围内，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的患病率正在上升，2018年全球平均发病率大约为25%[1]。它是一种复杂的疾病，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)和相关的肝硬化[1-2]。其中，NASH是NAFLD危及生命的阶段的转折点[3]。NASH发生肝纤维化的风险增加，肝纤维化可发展为肝硬化、肝细胞癌和终末期肝病[4]。值得注意的是，目前NASH的患病率已高达全球人口的5%，但仍缺乏有效的治疗手段[3]。因此，积极防治NAFLD具有重要的临床意义。

FXR是一种可被胆汁酸激活的受体，主要存在于肠道、肝脏、肾脏等器官中[5]，其在糖类、脂肪、蛋白质、胆汁酸等代谢中起重要作用[6-7]。正如Amano等[8]和Schmitt 等[9]报道一样，FXR被拮抗或者缺失，将会加重糖脂代谢紊乱，引起肝脏脂肪变性，甚至纤维化。目前FXR激动剂已应用于临床中NAFLD的治疗，表现出一定的效果[10]。

目前许多关于NAFLD的相关研究仍需要依赖于动物模型，以往研究关于NAFLD的常见动物模型有ob/ob小鼠、LDLr-/-小鼠、ApoE-/-小鼠等[11]。本实验以高脂饮食诱导FXR-/-小鼠建立NAFLD，为本课题组下一步研究联合益生菌靶向激动肠道FXR以改善高脂饮食小鼠的NAFLD提供了必备条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：6只(3雄3雌)FXR+/-小鼠购买于赛业(苏州)生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2018-0003，品系名C57BL/6-Nr1h4 tm1cyagen。经过3代繁殖，第3代得到FXR-/-小鼠30只(17雄13雌)。20只6周龄C57BL/6野生型雄鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0006。实验经郑州大学伦理委员会批准。

1.1.2试剂和仪器:辐照灭菌维持饲料和辐照灭菌杨木刨花垫料,江苏协同医药生物工程有限责任公司，苏饲证(2014)01008；45%高脂饲料(蛋白质20kcal%，碳水化合物35 kcal%，脂肪45 kcal%)，北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号SCXK(京)2014-0004；胰岛素溶液，江苏万邦生物医药集团有限责任公司[国药准字：H10890001]；血清指标(TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、TBA)试剂检测盒(深圳库贝尔生物科技股份有限公司)；引物(苏州金唯智生物科技有限公司)；总RNA抽提试剂TRIzol试剂(宝日医生物技术有限公司)；逆转录试剂盒ReverTra Ace© qPCR RT Kit(东洋纺生物科技有限公司)；RT-PCR试剂盒QuantiNova SYBR Green PCR Kit(凯杰生物技术有限公司)；HE染色试剂盒(生工生物工程股份有限公司)；自动生化分析仪(深圳库贝尔生物科技股份有限公司)；血糖仪和LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)；全自动脱水机、组织石蜡包埋机、轮转式切片机、摊片机、烘片机(Leica，德国)。

1.2 方法

1.2.1实验动物分组:实验动物适应性饲养1周后开始实验。从20只6周龄C57BL/6雄鼠中随机选取12只，分为2组，每组6只，记为ND(WT)组和HFD(WT)组。从17只6周龄FXR-/-雄鼠中随机选取12只，分为2组，每组6只，记为ND(FXR-/-)组和HFD(FXR-/-)组。

1.2.2建立实验模型: ND组给予辐照灭菌维持饲料喂养12周，HFD组给予45%高脂饲料喂养12周。实验小鼠均饲养于SPF级环境中，温度22～24 ℃，湿度65%～70%，自由饮水和进食，白昼-黑夜12 h循环。喂养过程中注意观察小鼠毛发、精神状态等一般情况有无异常，每周记录一次小鼠体质量变化。小鼠处死前1周行腹腔注射胰岛素耐量试验(insulin tolerance test, ITT)和腹腔注射葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)。处死后留取标本。

1.2.3实验操作

ITT：实验前小鼠禁食12 h。胰岛素溶液按照75U/kg体质量剂量进行腹腔注射。血糖仪分别于0、15、30、60、90、120 min检测小鼠血糖。

IPGTT：实验前小鼠禁食12 h。20%葡萄糖溶液按照10 mL/kg剂量进行腹腔注射。血糖仪分别检测0、15、30、60、90、120 min时间点血糖。

血清指标检测：采用自动生化分析仪和检测试剂盒测定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、TBA等指标。

实时荧光定量PCR：TRIzol试剂提取小鼠肝脏总RNA，通过逆转录试剂盒获得cDNA。以GAPDH为内参，通过2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

HE染色：取适量4%多聚甲醛固定好的小鼠肝脏，经脱水、包埋、切片、摊片、捞片、烘片等步骤依次处理后，采用HE染色试剂盒进行染色。显微镜下观察肝脏脂肪变性程度。

肝脏脂滴的平均数量和平均大小：HE染色完成后，电子显微镜拍照。利用Image J软件处理HE图片，导出数据进一步分析。具体如参考文献所示[12]。

1.3 统计方法

利用SPSS 22.0软件进行数据分析，采用ANOVA统计方法。其中P<0.05，P<0.01。作图采用GraphPad Prism 8.0软件。

2 结果

2.1 小鼠体质量、ITT、IPGTT、IPGTT曲线下面积及肝脏指数水平改变

与ND(WT)组相比，ND(FXR-/-)组小鼠体质量变化无差异。HFD(WT)组和HFD(FXR-/-)组小鼠体质量自第3周开始，体质量出现显著增加(P<0.01)(图1A箭头所指)，而HFD(WT)组和HFD(FXR-/-)组小鼠体质量无差异(图1A)。在ITT中，ND组小鼠血糖下降最低值出现在30 min左右，HFD(WT)组和HFD(FXR-/-)组小鼠表现出明显胰岛素抵抗，注射胰岛素后，其血糖下降最低值出现在60～75 min左右，其中HFD(FXR-/-)组小鼠各时间点血糖均高于HFD(WT)组(P<0.05)(图1B)。在IPGTT中，HFD(FXR-/-)组小鼠表现出极其严重的糖耐量受损，IPGTT曲线下面积提示HFD(FXR-/-)小鼠曲线下面积高于HFD(WT)组(P<0.01)(图1C和图1D)。为了观察小鼠肝脏大小变化情况，我们计算了小鼠肝脏指数(肝脏质量/小鼠体质量)，各组之间无统计学差异(图1E)。

图1 各组小鼠体质量、ITT、IPGTT、IPGTT曲线下面积及肝脏指数水平注：ITT，胰岛素耐量试验；IPGTT，腹腔注射葡萄糖耐量试验。*P<0.05，**P<0.01Fig.1 Body weight, ITT, IPGTT, the area under curve of IPGTT and liver index in the different groups of miceNote:ITT, insulin tolerance test; IPGTT, intraperitoneal glucose tolerance test. *P<0.05, **P<0.01

2.2 小鼠血清血脂水平及肝功能变化

与ND(WT)组相比，HFD(WT)组小鼠血清TC、TG和LDL-C含量均明显增加(P<0.01)。相比HFD(WT)组，HFD(FXR-/-)组小鼠血清TC、TG和LDL-C含量出现显著性升高(P<0.01)(图2 A、图2B和图2C)。与ND(WT)组相比，ND(FXR-/-)组小鼠HDL-C含量无差异，HFD(WT)组小鼠血清HDL-C含量降低(P<0.05)。与HFD(WT)组相比，HFD(FXR-/-)组小鼠血清HDL-C含量显著性升高(P<0.01)(图2D)。与ND(WT)组相比，ND(FXR-/-)组和HFD(WT)组小鼠血清ALT含量无变化，HFD(FXR-/-)组小鼠血清ALT含量约为HFD(WT)组2倍(P<0.01)(图2E)。ND(WT)组和HFD(WT)组小鼠血清AST含量无差异。相比HFD(WT)组，HFD(FXR-/-)组小鼠血清AST含量上升(P<0.05)(图2F)。

2.3 小鼠肝脏炎症因子、FXR下游基因及清道夫受体B族1型(scavenger receptor type-B1, SR-B1)表达水平

与ND(WT)组相比，HFD(WT)组小鼠肝脏炎症因子TNF-α和TLR4相对表达量无差异。与HFD(WT)组小鼠相比，HFD(FXR-/-)组小鼠TNF-α和TLR4相对表达量明显增加，分别约为HFD(WT)组的2.5倍和15倍(P<0.01)(图3A和图3B)。与ND(WT)组相比，ND(FXR-/-)组小鼠肝脏SHP表达量明显下降，而HFD(WT)组小鼠肝脏SHP表达量增加(P<0.01)。和HFD(WT)组相比，HFD(FXR-/-)组小鼠肝脏SHP表达量下降更明显(P<0.01)(图3C)。与ND(WT)组相比，ND(FXR-/-)组小鼠肝脏CYP7A1表达量明显增加(P<0.01)，HFD(WT)组小鼠肝脏CYP7A1表达量无变化。同样的，HFD(FXR-/-)组小鼠肝脏CYP7A1表达量为HFD(WT)组的5倍(图3D)。检测血清中胆汁酸含量，与ND(WT)组相比，HFD(WT)组小鼠血清胆汁酸含量无差异。ND(FXR-/-)组小鼠血清胆汁酸含量约为ND(WT)组的9倍，HFD(FXR-/-)组小鼠血清胆汁酸含量约为HFD(WT)组的27倍(P<0.01)(图3E)。与HFD(WT)组相比，HFD(FXR-/-)组小鼠肝脏SR-B1相对表达量下降，约为HFD(WT)组的1/4(P<0.01)(图3F)。

图2 各组小鼠血清指标水平注：*P<0.05，**P<0.01Fig.2 The levels of serum index in the different groups of miceNote:*P<0.05, **P<0.01

图3 各组小鼠肝脏炎症因子、FXR下游基因及清道夫受体B族1型(SR-B1)表达水平注：TNF-α，肿瘤坏死因子α；TLR4，Toll样受体4；SHP，小分子异源二聚体；CYP7A1，胆固醇7α-羟化酶；SR-B1，清道夫受体B族1型。*P<0.05，**P<0.01Fig.3 Expression of liver inflammatory factors, downstream genes of FXR and scavenger receptor B group 1 (SR-B1) in the different groups of miceNote: TNF-α, tumor necrosis factor α; TLR4, Toll-like receptor 4; SHP, small heterodimer partner; CYP7A1, cholesterol 7α-hydroxylase; SR-B1, scavenger receptor B family type 1.*P<0.05, **P<0.01

2.4 小鼠肝脏HE染色病理和脂滴分析

ND(WT)组和ND(FXR-/-)组小鼠镜下肝脏结构正常。 HFD(WT)组小鼠镜下肝索结构排列紊乱，整个肝小叶散在出现脂肪空泡，并胞内空泡变性程度近中央静脉处较轻，未见炎细胞浸润。HFD(FXR-/-)组小鼠镜下肝索排列紊乱，肝细胞混浊肿胀，视野内出现大量脂肪空泡，并空泡变性程度近中央静脉处越明显，偶见炎细胞浸润(图4)。利用Image J软件，我们对HE图片进行了量化处理，计算了相同视野下脂滴的平均数量和平均大小，并对数据进一步处理。结果表明，在相同视野下，HFD(FXR-/-)组小鼠脂滴数量明显多于HFD(WT)组(P<0.01)(表2和图5A)。HFD(WT)组小鼠脂滴中以200～400大小范围为主，而HFD(FXR-/-)组小鼠>800大小范围的脂滴占据了60%左右(图5B)。这些结果表明，在相同高脂饮食条件下，FXR-/-小鼠肝脏脂肪病变更为严重，脂滴以大泡病变为主。

图4 小鼠肝脏HE染色注：放大倍数 ×200Fig.4 Mice liver HE stainingNote:magnification ×200

表2 肝脏脂滴平均数量Table 2 The average number of liver lipid droplets

图5 肝脏脂滴数量和不同大小脂滴所占比例注：数据来源于Image J软件分析处理肝脏HE图片结果Fig.5 Calculation of the average number of liver lipid droplets and average droplet sizeNote: The data comes from the analysis results of liver HE images by Image J software

3 讨论

FXR在体内主导胆汁酸代谢，同时也是糖类、脂肪、蛋白质等代谢的关键因素[13-14]。早在2000年，Sinal等[15]已经证实FXR-/-小鼠能够诱导肝脏胆汁酸水平升高和肝脏损伤，进而引起肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。本文引文中提到的ob/ob小鼠，是作为饱食模型，促进小鼠形成NAFLD。LDLr-/-小鼠和ApoE-/-小鼠是通过影响脂蛋白合成或者分泌以诱导NAFLD的形成[11]。这些模型都是通过某一方面因素干预NAFLD的形成。而本实验选取FXR-/-小鼠，是因为FXR的缺失能够导致糖脂代谢紊乱、胆汁酸升高、肝脏脂肪变性形成[13-15]。换句话说，小鼠体内FXR被激动之后，可以缓解这些代谢紊乱，进而减轻NAFLD。

在Cariou等[16]和Ma等[17]实验中，通过高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术实验证实，FXR-/-小鼠出现严重的糖耐量受损和外周胰岛素抵抗，反映为对外周葡萄糖处理能力减弱。我们研究发现，HFD(FXR-/-)组小鼠表现出极其明显的胰岛素抵抗及糖耐量受损，ITT中血糖下降缓慢且不明显。IPGTT中各时间点血糖明显升高且血糖峰值后移，IPGTT曲线下面积明显高于其他组小鼠。HFD(WT)组小鼠虽也表现出胰岛素抵抗及糖耐量受损，但程度远不如HFD(FXR-/-)组。

同时我们也检测了血脂谱及肝功能变化，TC、TG、LDL-C、AST及ALT变化和预期相符，HFD(FXR-/-)组小鼠含量均高于其他组，表现出明显的脂质代谢紊乱和肝功能受损。值得关注的是HDL-C含量的变化，HDL-C通常被认为是一种保护性因子，可将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢，再由胆汁排出体外，被称为“好胆固醇”[18-19]。但在本实验中，HFD(FXR-/-)组小鼠的HDL-C反而明显增加。有研究表明，高脂饮食的FXR-/-小鼠肝脏清道夫受体B族1型(SR-B1)水平降低，而SR-B1在HDL-C转运中起重要作用[15，19-20]。我们考虑在FXR-/-小鼠中观察到的血浆HDL-C水平升高是由于肝脏对HDL-C的选择性摄取减少，并非HDL-C产生增多，这可能与SR-B1的表达下降有关。为此我们检测了各组小鼠肝脏SR-B1表达情况，结果表明HFD(FXR-/-)组小鼠肝脏SR-B1相对表达量明显下降，约为HFD(WT)组的1/5。

我们进一步检测了肝脏炎症因子指标，HFD(FXR-/-)组小鼠中TNF-α和TLR4相对表达量均明显增加，肝脏炎症明显。值得注意的是，相比普通饮食，高脂饮食条件下C57BL/6小鼠肝脏炎症水平并未增加。FXR在胆汁酸代谢中起主导作用，在肝脏中主要通过FXR→SHP→CYP7A1轴调节胆汁酸代谢[21]，因此我们检测了肝脏SHP、CYP7A1的表达水平。ND(FXR-/-)组和HFD(FXR-/-)组小鼠中SHP表达量均出现下降，是因为在FXR-/-小鼠中SHP失去了上游靶基因FXR的激动。但HFD(FXR-/-)组小鼠SHP表达量下降更明显，我们推测高脂饮食会进一步减弱FXR轴功能。CYP7A1受其上游靶基因FXR、SHP的负反馈调节，它是胆汁酸经典合成通路的关键酶，调节机体胆汁酸合成[21-22]。CYP7A1变化趋势与SHP相反。血清中胆汁酸含量也如预期结果，在FXR-/-小鼠中CYP7A1失去了上游靶基因控制后含量明显增加，促进肝脏胆汁酸的合成，ND(FXR-/-)组和HFD(FXR-/-)组小鼠血清胆汁酸含量均明显增加，但HFD(FXR-/-)组小鼠血清胆汁酸含量为ND(FXR-/-)组4倍，进一步证实高脂饮食对FXR轴功能的影响。

肝脏HE染色及脂滴分析结果显示HFD(FXR-/-)组小鼠肝脏出现弥漫大泡性脂肪空泡，同时可观察到间质偶有炎症细胞浸润。这些变化与前文提到的糖脂代谢紊乱、肝脏炎症、肝功能受损一起表明，高脂饮食诱导FXR-/-小鼠可引起糖脂代谢紊乱和肝脏脂肪变性。

虽然高脂饮食诱导FXR-/-小鼠表现出极其明显的代谢紊乱和肝脏大空泡脂肪变性，符合NAFLD疾病特征。但仍存一定缺陷，比如FXR+/-小鼠的制备过程长(4～6个月)、花费较高(约3000～4000元/只)、FXR-/-小鼠繁殖周期长(本课题组繁殖长达8个月)。但FXR-/-小鼠的应用，为进一步研究评价FXR激动剂对小鼠NAFLD的治疗效果提供基础。

综上所述，高脂饮食诱导FXR-/-小鼠可导致其产生明显的糖脂代谢紊乱、胆汁酸代谢异常、肝功能异常及肝脏脂肪变性。