何士俊 万毅虹 章嘉雯 蔡秀潮 刘静文 刘叔文 姚新刚

（广东省新药筛选重点实验室 南方医科大学药学院，广州 510515）

蛋白激酶 A［1］（Protein Kinase A，PKA）又称依赖于cAMP的蛋白激酶A，是一种结构最简单、生化特性清楚的蛋白激酶［2］。在大多数哺乳类细胞中，一类蛋白激酶A存在于胞质溶胶，另一类结合在质膜、核膜和微管上［3-4］。在胰岛β细胞中，PKA具有促进胰岛素分泌的作用［5-7］。研究表明，GLP-1与其受体结合［8］，激活胰升糖素样肽-1受体-环腺苷二磷酸-蛋白激酶A（GLP-1R-cAMP-PKA）通路［9］，促使腺苷酸环化酶活化，升高胰腺β细胞内cAMP浓度，激活PKA使葡萄糖信号转导途径中一些起关键作用的蛋白质磷酸化而促使胰岛素分泌［10］，包括对ATP敏感的钾离子通道Sur1［11］，电压依赖性的钙离子通道VDCC［12］，以及与胰岛素释放机制相关的分子，增加抗凋亡蛋白水平［13］；同时PKA还可激活cAMP反应元件结合蛋白（CREB）［14］和胰十二指肠同源盒基因（PDX-1），继而与CREB基因启动子区的一个关键性的DNA序列结合［15］，从而加强胰岛素原基因转录的效率，增加胰岛素的转录及合成［16］。但是PKA在促进胰岛β细胞分泌胰岛素中究竟发挥着多大的作用以及是否还有除PKA以外的作用途径仍不清楚；前期研究主要通过siRNA干扰［17］和采用抑制剂［18］等手段研究PKA在胰岛β细胞中的作用，这些手段并没有完全敲除胰岛β细胞中的PKA，其瞬时性和不彻底性的弊端会影响对基因功能的正确判断。因此，本研究采用CRISPR/Cas9技术定点敲除INS-1细胞中PKA C-α基因，得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株，以期对PKA在胰岛β细胞的作用进行更深入的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠胰岛瘤INS-1细胞、293T细胞、Stbl3感受态细胞，蛋白上样缓冲液（实验室保存）；lentiCRISPRv2（98290）、pCMV-VSV-G（8454）、psPAX2（12260）质粒购自 Addgene公司；polyjet转染试剂（SL100688）购自SignaGen生物技术公司；polybrene（TR-1003-G） 购 自 EMD Millipore公司；RPMI1640培养基（11875093）、DMEM培养基（10566016）、澳洲胎牛血清（10099141）、限制性内切酶BsmB I（FD0454）、FastAP去磷酸化酶（EF0654）、DTT（707265ML）、ECL化学发光液（RJ236892）、青霉素和链霉素（15140122）购自Thermoscientific公司；T4 PNK激酶（M0201S）、快速连接酶（M2200S）购自NEB公司；RIPA裂解液（P0013B）购自碧云天公司；质粒小提试剂盒（AP-MN-P-50）购自Axygen公司；胶回收试剂盒（28704）购自Aiagen公司；细胞基因组DNA提取试剂盒（D3396）购自Omega公司；嘌呤霉素（AAJ67236-8EQ）购自VWR 公司；PKA C-α抗体（D38C6）、β-actin抗体（D6A8）、辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔IgG（7074s）购自Cell Signaling Technology公司；2×HieffTMPCR Master Mix（10102ES03）购自上海翊圣生物科技有限公司；Insulin High Range Kit 500 tests（62IN1PEG）购自Cisbio公司；小向导RNA（sgRNA）序列合成及质粒测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 293T细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的高糖DMEM培养基；INS-1细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素、5.6mmol/L葡萄糖、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠、0.5 mmol/L b-巯基乙醇的RPMI 1640培养基，在37℃、5% CO2条件的细胞培养箱中培养。

转染前24 h，293T细胞铺6孔板，细胞密度为1×105cell/mL，转染前0.5 h用新鲜培养基换液。1 μg DNA（500 ng sgRNAlentiCRISPR质 粒、250 ng psPAX2质粒、250 ng pCMV-VSV-G质粒）混于50 μL无血清无双抗培养基，3 μL PolyJet转染试剂也溶于无血清无双抗培养基，孵育10 min，将PolyJet混合物加入DNA混合物，室温孵育10 min后加入6孔板中，24 h后更换培养基。

1.2.2 sgRNA靶点选择及其寡核苷酸链合成 应用http：//crispr-mit.edu/网站设计所需的目的基因sgRNA片段，设计时正义链模板的5'添加CACC，与BsmB I酶切后形成的黏性末端互补；反义链模板的5'端添加AAAC，与BsmB I酶切后形成的黏性末端互补，参考大鼠的基因组，对PKA C-α（Gene ID ：25636https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_005118.4?report=genbank&from=25095089&to=25118869）的10个外显子序列进行引物设计打分（https：//zlab.bio/guide-design-resources），选出2条分数最高的sgRNA序列分别如下：

所有寡核苷酸链和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成

1.2.3 lentiCRISPRv2-sgRNA质粒的重组构建 用BsmB I限制性内切酶线性化lentiCRISPRv2质粒，酶切体系如下：lentiCRISPRv2，5 mg；FastDigestBsmB I，3 μL ；FastAP，3 μL ；10× FastDigest Buffer，6 μL；100 mmol/L DTT（ 新 鲜 配 制 ），0.6μL；加水至60 μL；37℃中反应30 min完成后进行切胶回收。将sgRNA寡核苷酸单链退火形成双链，体系如下：Primer 1（100 μmol/L），1 μL；Primer 2（100 μmol/L），1 μL ；10× T4 Ligation Buffer，1 μL ；T4 PNK 激酶，0.5 μL；加水至 10 μL，37℃，30 min；95℃，5 min；95℃以5℃/min降至25℃；4℃保存，将退火引物用灭菌水按1∶200稀释。连接体系：线性化质粒lentiCRISPRv2，50 ng；稀释的退火引物，1 μL ；2×Quick Ligase Buffer，5 μL ；快速连接酶，1 μL；加水至11 μL，25℃链接 10 min。将连接得到的11 μL体系全部转化到Stbl3感受态中，挑取单克隆进行小摇，再进行小提质粒并测序验证。

1.2.4 慢病毒制备与感染 将293T细胞铺6孔板，待细胞密度生长至60%-80%。将构建好的sgRNA-lentiCRISPRv2质粒和慢病毒包装辅助载体psPAX2、pCMV-VSV-G质粒按照sgRNAlentiCRISPR∶psPAX-2∶pCMV-VSV-G为2∶1∶1的比例混合，将混合好的慢病毒表达系统转入293T细胞内，24 h后更换培养基，换成DMEM∶RPMI 1640为1∶1的培养基，换液24 h后收集细胞上清液即为慢病毒原液。感染前将INS-1细胞按2×105cell/well铺于12孔板中，24 h后细胞将近有80%密度，将病毒上清液按100mL/well加入INS-1细胞中，促感染剂polybrene以1∶1 000的比例加入，充分混匀。6 h后换液，继续培养。

1.2.5 敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株的初筛选与验证 sgRNAlentiCRISPR-Cas9慢病毒侵染INS-1细胞48 h后，更换为含1 μg/mL嘌呤霉素的RPMI1640培养基培养，待12孔板中对照孔的INS-1细胞全部死亡后，将其他孔的细胞转移至6孔板，待6孔板长满时一部分转移至25 cm3细胞皿中接着培养，另一部分则加入RIPA裂解液提取蛋白，加入蛋白上样缓冲液并于沸水浴中反应10 min，将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳（80 V，20 min跑浓缩胶；120 V，1.5 h跑分离胶）；再采用湿转法以100 V，1 h的条件转移至PVDF膜；以5%脱脂奶粉室温封闭1 h；内源性PKA C-α抗体4℃ 过夜孵育，TBST洗膜3次，每次10 min；HRP偶联的羊抗兔IgG室温孵育1 h，TBST洗膜6次，每次5 min；ECL化学发光液进行显影、曝光。

1.2.6 敲除PKA C-α基因的INS-1单克隆细胞的挑选与测序鉴定 由Western blotting印记验证有敲低效果的INS-1细胞按5 cell/mL的密度铺到96孔板中，待24 h细胞贴壁后在显微镜下找出只有单个INS-1细胞的孔，继续扩大培养，在96孔板长满时（一般5-6周左右），转移至12孔板继续培养，待12孔板长满后，一部分转移至25 cm3细胞皿中接着培养，另一部分提蛋白验证是否有敲除效果。将有敲除效果的INS-1细胞用Tissue DNA Kit D3396试剂盒提取细胞DNA，再经过PCR扩增（PKA C-α基因PCR扩增引物为：Forward primer：CTCTCCCTGCTCCCAGAGAA，Reverse primer：ATGAGTCCAAGGCCAGCTTC）， 扩增体系为：模板DNA，适量；Forward primer（10 μmol/L），2 μL ；Reverse primer（10 μmol/L），2 μL ；2×HieffTM PCR Master Mix，25 μL ；加水至 50 μL，94℃，5 min，1个循环；94℃，30 sec，35个循环；60℃，30 sec，35个循环；72℃，30 sec/kb，35个循环；72℃，10 min，1个循环。PCR扩增完成后的产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行T载体克隆，测序结果与PKA C-α基因进行比对。

1.2.7 葡萄糖刺激胰岛素分泌实验 （GSIS）将INS-1细胞接种在24孔板中并在5% CO2、37℃中孵育48 h，待INS-1细胞密度达到80%-90%时，将细胞与含有0.2% BSA的Krebs-Ringer Bicarbonate HEPES buffer（KRB 缓 冲 液：115 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，24 mmol/L NaHCO3，2.5 mmol/L CaCl2和10 mmol/L HEPES）预孵育2h，然后以低糖（2.8 mmol/L葡萄糖）或高糖（16.8 mmol/L葡萄糖）刺激INS-1细胞2 h（葡萄糖配在含有0.2% BSA的KRB缓冲液中），最后收集细胞上清液以测定胰岛素分泌。使用胰岛素试剂盒Insulin High Range Kit 500 tests测量胰岛素浓度。

1.2.8 统计分析 使用Graph Pad Prims5软件的One-Way Anova分析统计学显着性。数值表示为*P＜0.05，**P＜0.01，和 ***P＜0.001。如果没有另外说明，误差条代表平均值的SD。

2 结果

2.1 sgRNA靶点以及寡核苷酸序列设计

lentiCRISPRv2质粒信息见图1-A；本研究针对PKA C-α基因的两个外显子Exon 5和Exon 7设计sgRNA序列，分别为sgRNA2和sgRNA1，其插入位置和序列信息见图1-B。sgRNA靶点以及寡核苷酸序列见表1。

图1 靶向PKA C-α基因的sgRNA的设计

表1 PKA C-α-sgRNA寡核苷酸序列

2.2 LentiCRISPRv2-sgRNA构建质粒的测序结果

针对PKA C-α基因构建重组LentiCRISPRv2-sgRNA质粒，测序结果（图2）显示，两条sgRNA序列均正确插入lentiCRISPRv2，插入序列的位置、方向及序列与预期相符，证明载体构建完全正确。

2.3 敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株的初筛选与验证

用1 μg/mL嘌呤霉素的RPMI1640培养基培养INS-1细胞至对照组细胞全部死亡后（24 h），抽提细胞蛋白进行Western blotting印记验证，结果（图3）显示，PKA C-αsgRNA1基本没有敲低效果；PKA C-αsgRNA2敲低效果很明显。对PKA C-αsgRNA2细胞组进行有限稀释进而筛选出单克隆细胞。

2.4 建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株

将PKA C-αsgRNA2细胞组按5 cell/mL的密度铺到96孔板中，挑选出单克隆细胞即为PKA C-α基因敲除的细胞（KO细胞）（大约5-6周），抽提细胞蛋白进行Western blotting印记验证（图4-A）；同时提取PKA C-α基因敲除细胞（KO）和野生型细胞（WT）的DNA进行PCR扩增，并采取T克隆测序，测序后与原基因组DNA进行对比（图4-B），结果（图4-C）显示KO细胞发生1bp碱基的插入突变。Western blotting印记验证结果和T克隆测序结果证实PKA C-α基因敲除成功，稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株建立成功。

图2 LentiCRISPRv2-sgRNA测序图

图3 Western blotting印迹初步鉴定

2.5 敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力检测

葡萄糖刺激胰岛素分泌实验结果（图5）显示，敲除PKA C-α基因的INS-1细胞低糖刺激下，其胰岛素的分泌较正常的INS-1细胞少，结果无显著性差异；但在高糖刺激，其胰岛素的分泌较正常的INS-1细胞更少，结果有显著性差异，说明敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素的分泌能力降低。

3 讨论

基因编辑技术［19］的飞速发展为基因功能研究工作提供了更多有力的工具，特别是锌指核酸酶（FZN）［20］、转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）［21］和最近发展起来的CRISPR技术［22-24］以及基于CRISPR/Cas9基因编辑技术改进的单碱基编辑技术，为基因编辑提供了前所未有的方便和快捷。单碱基编辑技术（Base editor，BE）通过将Cas9切口酶（Cas9 nikase，Cas9n）或无核酸酶活性的Cas9（nuclease dead Cas9，dCas9）与胞嘧啶脱氨酶形成融合蛋白，并通过sgRNA（单链向导RNA）将融合蛋白靶向靶位点，在不切割双链DNA的情况下对靶基因位点的单个碱基进行胞嘧啶C→胸腺嘧啶T或鸟嘌呤G→腺嘌呤A的精准编辑，在人细胞系和小鼠细胞系中，这种剪辑编辑器永久性地和高效地将碱基胞嘧啶（C）转化为碱基尿嘧啶（U），同时具有较低的编辑错误发生率［25］。相对于其他基因编辑技术，本实验选择CRISPR/Cas9技术，一方面是由于用于基因敲除的CRISPR 载体构建极其简单，只需要根据推荐的序列合成spacer并将其整合进载体，就完成了基因编辑载体体外的操作过程且其特异性好，可以实现多基因编辑［26］；另一方面，本实验采用的慢病毒［27］侵染效率极高，几乎能感染所有组织来源的细胞［28］；其次，慢病毒载体颗粒在细胞内保持高度的稳定性，维持细胞内病毒量，增加感染率。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9应用广泛［29-30］，迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。

图4 Western blotting印迹鉴定及DNA测序结果

图5 PKA C-α基因敲除对INS-1细胞胰岛素分泌的影响

糖尿病是我国高发病率的疾病，由于糖尿病产生多种并发症，目前尚无特效治疗药。其中2型糖尿病发病的主要机制是胰岛β细胞分泌功能的异常［31］，胰岛素分泌对维持血糖稳态起着重要的作用，是表征胰腺β细胞功能正常的重要指标。因此促进胰岛β细胞分泌胰岛素对2型糖尿病者控制血糖是有效的，甚至对预防糖尿病的发生也有一定的作用。目前也有许多药物可以促进INS-1细胞胰岛素的分泌［32-34］。前期研究表明PKA具有促进胰岛素分泌的作用，但是PKA在促进胰岛素分泌的过程中究竟发挥多大的作用仍未清楚。本实验利用敲除PKA C-α基因来检测PKA C-α对INS-1细胞胰岛素分泌的影响。参考大鼠的基因组，对PKA C-α的10个外显子序列进行引物设计打分，选择两个打分最高的外显子序列设计引物并构建慢病毒质粒，即 lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 5-sgRNA、lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 7-sgRNA质粒，本实验目的是构建敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株并且研究PKA C-α蛋白对胰岛素分泌的影响，故直接采用Western blotting印记法验证敲除结果，不仅可以缩短实验周期和节省试剂耗材，而且蛋白水平上的变化更能反应PKA C-α基因的敲除效果，结果具有说服力。实验结果表明lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 7-sgRNA质粒无敲低效果，可能是由于该sgRNA设计不合理或者脱靶效应的产生等；lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 5-sgRNA质粒敲低效果很明显，故将该组细胞进行T克隆测序，结果显示，该组细胞的DNA与野生型INS-1细胞DNA的对比，插入了1bp碱基，这说明sgRNA-Cas9慢病毒入侵INS-1细胞后，sgRNA准确地靶向了PKA C-α基因的5号外显子，随后Cas9核酸酶在靶位点产生DNA双链断裂，INS-1细胞DNA在修复过程中，产生了插入突变，导致PKA C-α基因无法转录与翻译；其次，PKA C-α基因敲除后，INS-1细胞胰岛素分泌能力大大下降，提示PKA C-α对于INS-1细胞胰岛素分泌发挥着重要的作用；此外，本实验构建的稳定敲除PKA C-α基因的细胞株，与敲除PKA C-α基因动物模型相比，构建时操作较为简单，成功率高，成本低，可以很快实现。

4 结论

本实验采用基因编辑技术CRISPR/Cas9系统成功的敲除了INS-1细胞中的PKA C-α基因，构建了稳定敲除PKA C-α基因的细胞株，为更深入研究PKA在胰岛b细胞的功能提供了依据。