赖广华，杨晓婷，赖名溪，卓李圆

（广东省深圳市龙华区中心医院 病理科，广东 深圳 518110）

卵巢肿瘤是仅次于宫颈癌和子宫内膜癌的妇科肿瘤，以上皮型最为多见，由于早期缺乏特异的临床症状和可靠的诊断方法，绝大多数患者发现时已经出现远处转移而错失了治疗良机。随着医疗水平的迅猛发展，从分子生物学水平研究肿瘤的发生和发展成为热点。CD73 是一种T 淋巴细胞分化抗原，广泛存在于多种组织中，参与离子交换、液体转运等生理过程。近年来有学者发现多种恶性肿瘤中出现CD73 高表达，并与肿瘤组织的微血管密度和侵袭转移密切相关［1］。转录因子叉头框C2（forkhead box protein C2, FOXC2）是胚胎时期与血管及淋巴管形成有关的重要因子，随着肿瘤分子生物学的兴起，研究者们发现FOXC2还是宫颈癌发生、发展、转移和侵袭的必要因子，并在子宫内膜癌也存在高表达现象［2］。但CD73、FOXC2 在上皮性卵巢肿瘤中的表达和临床-病理关系报道甚少，本研究就这一方向展开讨论，以期为卵巢肿瘤的早期诊断、预后评估及靶向治疗提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2017 年6 月至2018 年10 月手术切除的卵巢组织标本130 例为研究对象，均为首次手术，术前未接受放化疗，无其他部位肿瘤病史，均经病理确诊，患者对本次研究知情同意、临床及随访资料完整。入选患者年龄为27～75 岁，平均（46.4±9.3）岁；其中良性上皮性肿瘤30 例（浆液性15 例，粘液性15 例），交界性上皮性肿瘤35 例（浆液性18 例，粘液性17 例），恶性上皮性肿瘤45 例（浆液性29 例，粘液性16 例；临床Ⅰ～Ⅱ期14 例，Ⅲ～Ⅳ期31 例；淋巴结转移24 例，无转移21 例；病理组织学分级：G1 9 例，G2 15 例，G3 21 例），因其他疾病切除的正常卵巢组织20 例。正常组织及病变组织标本均为两份。

1.2 仪器与试剂

BX-51 荧光显微镜（日本尼康公司）；鼠抗人CD73 单克隆抗体、鼠抗人FOXC2 单克隆抗体、免疫组化染色试剂盒、山羊血清（北京中杉生物公司）；非生物素免疫组化检测系统（北京中杉生物公司）

1.3 方法

采用免疫组化法检测卵巢组织标本中CD73、FOXC2 的表达，以已知阳性切片为阳性对照，以硫化铅代替一抗为阴性对照。取出经烤片、脱蜡、逐级乙醇、3%过氧化氢溶液处理后的标本（一式两份），PBS 液清洗3 次，在弱酸液中进行高温高压修复。加入10%山羊血清中和非特异反应。同一患者的两份标本分别加入一抗（1∶200）鼠抗人CD73 单克隆抗体和鼠抗人FOXC2 单克隆抗体，4℃冰箱中保存过夜。复温后加入二抗（PV6000通用型抗体）。DAB 染色液染色，苏木素复染，乙醇脱水，树胶封片，显微镜下观察。

1.4 结果判定

CD73 位于包膜或胞浆，镜下细胞结构清晰，阳性表达的判定标准：电镜下发现胞浆和包膜出现棕黄色或褐色颗粒，突出于背景细胞颜色。表达强度判定：细胞无着色或淡黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分；取5 个视野，每个视野计100 个细胞，阳性细胞占0%～10%计1 分，＞10%～50%计2 分，＞50%～100%计3 分。记录两项评分乘积：1～3 分为低表达，≥4 分为高表达（强度Ⅰ级为4 分，Ⅱ级为6 分，Ⅲ级为9 分）。FOXC2 位于胞浆和胞核，镜下呈现棕黄或棕褐色颗粒为阳性表达。表达强度判定：细胞不着色计0 分，淡黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分；阳性细胞占0%～10%计1 分，＞10%～50%计2 分，＞50%～80%计3 分，＞80%～100%计3 分。记录两项评分乘积：0～2 分为阴性（-），3、4 分为弱阳性（+），6、8 分为阳性（++），9、12 分为强阳性（+++）。

1.5 统计学方法

本次研究中所涉及到的数据均采用SPSS 20.0软件进行整理和分析。计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验，相关性检验采用Spearman 相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD73 在不同卵巢组织中的表达

镜下可见上皮性卵巢癌组织细胞的胞浆、包膜上出现棕黄或棕褐色颗粒，突出于背景细胞，视野中几乎被阳性细胞充满；交界性上皮性卵巢肿瘤组织也出现棕黄色颗粒，分布较卵巢癌组织稀疏；正常卵巢组织几乎无染色，见图1。CD73在正常、良性、交界性及恶性卵巢组织中的高强度表达率分别为0.0%、20.0%、25.7% 和82.2%，两两比较，良性与交界性卵巢组织CD73 高表达率差异无统计学意义（χ2=0.297,P=0.586），正常卵巢组织CD73 高表达率均低于良性、交界性及恶性卵巢组织，组间差异均有统计学意义（χ2=4.546,P=0.033；χ2=6.149,P=0.013；χ2=38.175,P=0.000），见表1。

2.2 FOXC2 在不同卵巢组织中的表达

镜下可见上皮性卵巢癌组织细胞胞浆和胞核中呈现棕褐色颗粒状，阳性细胞占视野比例大；良性上皮性卵巢肿瘤组织染色较浅，呈棕黄色，阳性细胞占视野比例较恶性小；正常卵巢组织未见染色细胞，见图2。FOXC2 在正常、良性、交界性及恶性卵巢组织中的阳性表达率分别为5.0%、23.3%、28.6% 和86.7%，两两比较，良性与交界性卵巢组织FOXC2 阳性表达率差异无统计学意义（χ2=0.230,P=0.632），正常卵巢组织FOXC2 阳性表达率均低于良性、交界性及恶性卵巢组织，组间比较差异均有统计学意义（χ2=3.562,P=0.046；χ2=4.420,P=0.036；χ2=39.016,P=0.000），见表1。

图1 镜下所见CD73 在不同卵巢组织中的表达情况

表1 不同卵巢组织中CD73、FOXC2 的表达情况 （n=130）

图2 镜下所见FOXC2 在不同卵巢组织中的表达情况

2.3 上皮性卵巢肿瘤CD73、FOXC2 表达与临床病理参数的关系

上皮性卵巢肿瘤CD73 高表达率及FOXC2 阳性率与组织学分级、临床分期及有无淋巴结转移有关（P＜0.05），组织学级别高、临床中晚期及有淋巴结转移的肿瘤组织CD73 高表达率高、FOXC2阳性率高。上皮性卵巢肿瘤CD73、FOXC2 表达与年龄及组织学分型无关（P＞0.05），见表2。

2.4 上皮性卵巢肿瘤CD73、FOXC2 表达相关性

Spearman 相关分析显示，上皮性卵巢肿瘤CD73 与FOXC2 表达呈线性正相关关系（r=0.833,P=0.004）。

表2 上皮性卵巢肿瘤CD73、FOXC2 表达与临床病理参数的关系

3 讨论

卵巢癌是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一，其起病隐匿，发病机制复杂，手术难度大，5年生存率低，需要先进的早期诊断技术和治疗手段。基因水平的治疗和疾病发掘一直是精准医学努力的方向，目前广泛应用于肿瘤相关疾病的治疗过程中［3］。本研究对上皮性卵巢癌进行分子水平的新型标志物的探究。

CD73 是通过糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol, GPI）锚定在细胞膜上的一种多功能糖蛋白，其不仅在T 淋巴细胞中具有刺激信号分子的作用，并且在淋巴细胞与内皮细胞结合的过程中充当黏附分子的角色［4］。机体绝大多数组织中可检测到CD73 表达，CD73 附着于组织细胞的胞膜或游离于胞浆中，参与离子交换、液体转运、组织乏氧及血管渗漏等病理生理过程［5-6］。FOXC2 是具有 DNA-结合域的翼状螺旋转录因子超家族中的一员，可在血管、软骨组织、肾脏及间质等部位表达，在胚胎的发育中起重要作用［7-8］。近年来，研究发现 CD73、FOXC2 与上皮性卵巢肿瘤的关系较为密切，Munger 等人在体外用恶性腹腔积液处理卵巢癌细胞，发现胞浆中CD73 和 FOXC2 的表达明显上调［9-10］。Kriplani 还通过体内试验证实了CD73 高强度表达与肿瘤组织微血管形成、侵袭和转移有关，他认为卵巢肿瘤微环境的改变可能是诱导CD73 高表达的原因之一，反之CD73 高表达也促进了血管淋巴管生成，为肿瘤细胞提供更充足的养分，造成了分子表达与微环境之间相互促进这一恶性循环［11-12］。

本研究结果显示，CD73 与FOXC2 在上皮性卵巢肿瘤细胞中呈现棕黄色或棕褐色、突出于背景的颗粒状表达，恶性组织细胞中CD73 呈高强度表达，表达率为82.2%，FOXC2 阳性率为86.7%，显著高于良性及交界性组织，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步提示了在恶性上皮性卵巢肿瘤的发病和病情恶化中CD73 可能起到关键作用。良性与交界性卵巢肿瘤CD73 表达强度介于恶性组织和正常组织之间。这一差别使得CD73、FOXC2 作为不同良恶程度卵巢肿瘤鉴别依据成为可能。但产生这一现象的原因尚未明确，除了微环境假说外，还可能与肿瘤组织中乏氧诱导致癌信号增加，促进CD73、FOXC2 表达有关，炎症因子低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）、转化生长因子-β （transforming growth factor-β, TGF-β） 可能也参与其中［13-14］。本研究还发现 CD73、FOXC2 高表达与组织学分级、临床分期及有无淋巴结转移有关，组织学级别高、临床中晚期及有淋巴结转移的肿瘤组织CD73、FOXC2 表达强度高。可能与CD73、FOXC2 促进肿瘤组织微血管生成，增加癌细胞侧向运动能力有关，与卵巢肿瘤临床病理特征的这一相关性可作为评估疗效和预后方法［15］。Spearman 相关分析显示，CD73 与FOXC2 在上皮性卵巢肿瘤的表达呈正相关关系（r=0.833,P=0.004），两种标志物的联合分析对于上皮性卵巢癌的早期诊断和预后评估具有重要的意义。

综上所述，在上皮性卵巢肿瘤细胞中CD73 与FOXC2 呈现高强度表达，并与肿瘤的转移和侵袭密切相关，可作为上皮性卵巢肿瘤早期诊断和预后评估的免疫分子标志物。