赵利，姚鹏

（黄河三门峡医院 生殖医学科，河南 三门峡 472000）

生殖是人类生命延续的自然过程，由于人类生存环境的污染及各种物理化学因素的作用，导致卵子、精子的质量下降，影响了人类的正常生殖活动［1］。为延续生命过程，辅助生育技术便应运而生，其中以体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）为主的辅助生殖技术已广泛应用于不孕症的治疗中，但受孕率却不尽如人意［2］。研究［3-5］表明，胚胎质量是辅助生殖技术成功与否的关键因素，而影响其生存、发育的因素较多，如促超排卵方案的应用、实验中采卵及采精的过程以及其他还未意识到的因素，因此质量控制是辅助生殖实验室质量保证的一个重要环节，其中较为重要的内容就是检测各种器皿及试剂对胚胎是否存在有害的内毒素。小鼠培养是监测实验室培养环境的重要指标，因此本研究以小鼠体内外受精及胚胎培养实验进行质控评估，以期为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雌性昆明白鼠，4～6 周龄，体重（20.35±2.03）g；雄性昆明白鼠，8 周龄以上，体重（30.25±3.11）g，购自上海斯莱克实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（沪）2012-0002。实验前所有小鼠适应性饲养7 d，室温20℃～25℃，12 h 昼夜交替。

1.1.2 言要试剂 注射用孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）、绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, hCG）（杭州动物药品厂），以10 mL 0.9%生理盐水将其溶解，于-20℃分装保存；卵裂液（CSC）、人输卵管液（human tubal fluid, HTF）、HEPES 缓冲的人输卵管液（modified human tubal fluid, mHTF）、合成血清蛋白（SSS）（欧文公司产品）、胚胎处理液、洗精受精液、卵裂胚培养液G1、囊胚培养液G2、人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）（瑞典Vitrolife 公司）等。

1.1.3 言要仪器 恒温超净工作台、培养皿、二氧化碳（CO2）培养箱（德国）、解剖显微镜、倒置显微镜（日本）、三气培养箱（丹麦）、CO2浓度检测仪（德国）等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠超排卵 选取雌鼠于实验前4 d 的16∶00 时腹腔内注射 PMSG 10 IU/只（0.1 mL），48 h后于腹腔内注射hCG 10 IU/只（0.1 mL）。

1.2.2 体内外受精实验 实验将小鼠分为体内受精与体外受精组。体内受精组：在注射hCG 后将雌雄按照1∶2 的比例进行合笼，次日早上观察雌鼠有无阴栓。对于有阴栓的雌鼠以颈椎脱臼法处死，在无菌条件下取其输卵管，洗涤3 次后，用针头套在输卵管伞上，收集2 期胚胎，于37℃下，在6%的CO2浓度培养箱中培养，观察并记录40 h、46 h、64 h 胚胎发育情况。体外受精组：在注射hCG 15～16 h 后，以颈椎脱臼法处死雌鼠，于无菌环境下取出输卵管，冲洗3 次后，在体视镜下，用注射针套刺破输卵管膨大部位，使其卵子团释放出来，并将其收集至G-IVF 受精液中，于37℃下，在6%的CO2浓度培养箱中等待受精。以同样的方法处死雄鼠，无菌环境下取出附睾尾，冲洗3次后用镊子轻轻取出精子，收集精子悬液于含有G-IVF 液的试管中，获能后，取适量精子悬液加入到含有卵子团的G-IVF 液中，移于37℃下、6%的CO2浓度培养箱中培养。而后在受精4 h 将卵子移入另一个含有G-IVF 液的受精皿中培养。

1.3 统计学方法

用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较进行t检验，计数资料以百分率（%）表示，两组间比较进行χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体外受精结果

本研究进行了3 个批次共21 个周期的小鼠体外受精实验，共获卵968 枚，其中原核受精卵765 枚，受精率 79.03%，2-细胞数 704 枚，卵裂率92.03%，2-细胞形成囊胚552 个，囊胚形成率为78.41%，见表1。

2.2 小鼠体内受精结果

本研究进行了13 个周期的体内受精实验，共获卵472 个，其中原核受精胚367 个，受精率为77.75%，2-细胞数351 枚，卵裂率95.64%，2-细胞形成囊胚286 个，囊胚形成率为81.48%，见表2。

表1 小鼠体外受精结果

表2 小鼠体内受精结果

2.3 小鼠胚胎体内外受精结果比较

体内外受精组的受精率分别为（77.64±5.38）% 、（79.01±1.24）% ， 卵 裂 率 分 别 为（95.48±1.06）%、（92.04±1.01）%，囊胚形成率分别为（81.42±1.13）%、（78.15±0.98）%，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

随着人类辅助生殖技术的不断发展，IVF-ET技术已成为当前治疗不孕症的主要手段，但在辅助生殖的过程中有很多环节会影响胚胎质量，导致患者的平均妊娠率较低。其中实验室的培养环境是较为重要的一个环节，因此需要在该过程中有严格的实验室质量控制系统及严格的实验室操作程序，以尽可能地降低各个环节对胚胎潜在的危害，保证胚胎质量［6-7］。1985 年 ACKERMAN 等首次尝试用2-细胞鼠胚作为实验室质控的方法，由于鼠胚与人胚有着近乎相同的发育历程，因此鼠胚是监测人早期胚胎体外发育环境的最好模式，可用来监测人类辅助生殖技术的几乎所有程序［8-9］。通过对IVF 实验室进行质量控制，并提高相关实验人员的操作水平，从而保证IVF 技术操作的准确性及可靠性。

研究［10］显示，鼠胚胎的体外受精较体内受精对胚胎发育的影响因素更加敏感，因而更有利于监测出对胚胎发育不利的因素。由于实验室是体外孕育胚胎的唯一场所，而受精卵与早期胚胎对微环境的要求较高，对培养环境的变化十分敏感，因此在实验需在无菌、无毒及无污染的环境中进行［11-13］。本研究通过对体内外受精两组方法的对比，对实验室的培养系统进行了全面的质量评估，结果显示，两组在受精率、卵裂率、囊胚形成率间差异无统计学意义，且各项指标均符合人类辅助生殖实验室质量控制标准。笔者在实验过程存在一些问题：温度设置欠佳时，会导致胚胎发生不可逆的损伤，需要借助加温装置，使温度维持在37℃，以提高受精率与怀孕率；光照时间延长会影响早期胚胎发育；若技术人员操作不够熟练，导致操作时间过长，也会影响胚胎的后续发育；此外选择周龄较长的雌鼠，会使排卵效果降低，导致配子的质量下降。

综上，鼠胚实验过程中的较多因素会影响受精率、囊胚形成率等，因此需尽可能地控制影响胚胎发育的可控因素，同时还需提高实验人员的操作技能等。因而在辅助生殖实验中，利用鼠胚实验可建立一套健全、完整的质量控制体系以确保培养环境及系统的可靠性，能为临床诊治提供依据。