刘 剑 李南林

(肇庆市林业局森林病虫害防治检疫站，广东 肇庆 526040)

我国作为世界上竹林面积最大、竹类资源最为丰富的国家，竹材资源的利用始终受到木质素降解的影响，导致竹类资源一直难以实现综合利用[1-3]。竹材木质素因木质素化学结构复杂，常同纤维等物质结合紧密，难于降解[4]。因此，竹材木质素的降解一直受到研究者的关注，而天然竹材木质素的降解是在自然条件下，通过多种微生物共同作用完成的，而微生物对竹材木质素的降解不仅有降解率高的优点，而且还能实现竹材资源的再利用，筛选具有良好降解能力的木质素降解菌一直是研究者关注的问题[5-6]。文章以天然竹林中腐烂的竹材为材料，通过筛选得到一株具有竹材木质素降解能力的菌株，利用形态学和分子生物学对菌株进行鉴定，为解决竹材木质素降解及竹纤维提取等竹资源应用方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

分离样品采集于广东省肇庆市广宁县市属葵垌国有林场天然竹林中腐烂的竹材。

1.2 培养基

真菌培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（以下简称：PDA 培养基）；PDA 基础培养基中分别加入愈创木酚（0.5 g/L）和苯胺蓝（0.1 g/L）制作PDA-愈创木酚培养基和PDA-苯胺蓝培养基；液态产酶培养基(g/L）：葡萄糖 20 g/L，酒石酸铵0.2 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，硫胺素(VB1)0.1 g/L，CuSO47H2O 0.007 g/L，MnSO40.035 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L，COCl2·6H2O 0.001 g/L，吐温-80 1.0 g/L[7]。

1.3 方法

1.3.1 筛选竹材木质素降解菌 通过平板稀释法、平板划线法对竹材木质素降解菌进行分离纯化，将分离纯化的菌株通过PDA-愈创木酚变色及PDA-苯胺蓝退色反应进行初筛，将初筛得到的菌株进行酶活力复筛，主要测定3 种木质素降解酶活力，其中漆酶（Lac）活性测定采用愈创木酚法[8]；木质素过氧化物酶（Lip）活性测定采用黎芦醇法[9]；锰过氧化物酶（Mnp）活性测定采用微量法[10]。

1.3.2 菌株的鉴定

（1）菌落的形态观察鉴定

将FG-22 菌株在PDA 培养基上进行培养，对平板上菌落形态和菌丝进行观察并根据魏景超著真菌分类学手册《真菌鉴定手册》[11]进行鉴定分类。

（2）菌株的分子生物学鉴定

对FG-22 菌株的基因组总DNA 提取方法采用CTAB 法[12];以ITS1（5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’）和ITS4（5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’）为引物对提取的DNA 进行PCR 扩增[13], PCR 扩增条件参照文献[14]，并将PCR 扩增产物委托铂尚生物技术（上海）有限公司进行基因测序；通过将所测得的18SrDNA 序列与NCBI 的GenBank 数据库中的基因序列进行相似性比较分析，再通过MEGA 软件构建系统进化发育分析，构建菌株的系统进化发育树。

2 结果与分析

2.1 木质素降解菌株的筛选分离

利用腐烂的竹材，根据不同的菌落形态通过平板划线法分离纯化得到74 株真菌菌株。

2.2 木质素降解菌的初筛

2.2.1 PDA-愈创木酚平板显色的筛选结果 将2.1 筛选分离得到的74 株真菌接种到PDA-愈创木酚平板培养基上进行显色反应，其中19 株菌株产生明显的显色反应。显色反应结果详见表1。显色反应见图1。

表1 PDA-愈创木酚平板显色初筛19 个菌株的显色结果Tab.1 Primary screening of 19 strains by PDA-Guaiacol plate chromatography

注：- 表示不显色；±代表开始显色；+、+ +、+ + +、+ + + +显色圈逐渐增大Note: - indicates no color rendering; ± indicates start of color rendering; +, + +, + + +, + + + + color developing circles increase gradually

通过表1 可以得出，19 个菌株都可在PDA-愈创木酚平板培养基上产生显色反应，颜色随着时间的延长不断增强。而不同的菌株在显色时间和显色圈大小有差异，FG-08、FG-19、FG-22、FG-45、FG-63和FG-69 等6 个菌株显色反应较快，并且显色圈较大。由此可判断出FG-08、FG-19、FG-22、FG-45、FG-63 和FG-69 这6 株菌具有较强的产漆酶（Lac）能力。

2.2.2 PDA-苯胺蓝平板退色的筛选结果 根据PDA-愈创木酚平板显色反应结果，将在PDA-愈创木酚平板显色的19 种菌株接种在PDA-苯胺蓝中进行退色反应。

表2 菌株的PDA-苯胺蓝平板退色反应结果Tab.2 Discoloration of fungi by PDA-Aniline Blue Plate

图1 菌株FG-22 愈创木酚变色及苯胺蓝退色Fig.1 Discoloration of guaiacol and decolorization of aniline blue by fungus FG-22

通过表2 可以看出，19 种菌株中发现有7 株菌（FG-04、FG-19、FG-22、FG-27、FG-33、FG-45 和FG-69）在PDA-苯胺蓝平板上发生明显退色反应，并且在第4-6 天退色较为明显的为FG-19、FG-22、FG-45、FG-69，并且出现全退色现象。由此初步表明这4 株菌株有产过氧化物酶类（Mnp 和Lip）的能力，而其他菌株未发生退色反应或退色反应不明显，表明不产生降解木素质的过氧化物酶类。PDA-苯胺蓝退色反应详见图1。

2.3 4 个菌株的复筛

根据以上PDA-愈创木酚平板显色反应及PDA-苯胺蓝平板退色反应的初筛结果，对FG-19、FG-22、FG-45、FG-69 菌株进行液态产酶复筛，测定其各自发酵液中漆酶（Lac）及过氧化物酶类（Mnp 和Lip）的酶活力，结果见图2 和图3。

图2 4 个菌株的Lac 酶活变化Fig.2 Breakdown charts of lactase activities of four fungi

图3 4 个菌株的过氧化物酶类（Mnp 和Lip ）酶活变化Fig.3 Breakdown charts of peroxidase (Mnp and Lip) activities in four fungi

从图2 可以看出，4 个菌株均可出产Lac，随着培养时间的延长酶活力不断发生变化。从第5 天起各菌株的酶活明显增高，在7～9 d 时分别达到产酶高峰值。在第7 天，FG-22 具有最高的产酶值，其酶活可达到10.8 U·mL-1，是FG-69 的7.14 倍。FG-19 和FG-45 的产酶能力比较接近。在酶活达到最高峰后，各菌株酶活开始逐渐下降直至趋于稳定。

从图3 可以看出，4 个菌株均有一定产生过氧化物酶类（MnP 和LiP）的能力。在第9 天，FG-22 达到最大产酶高峰，酶活力为20.16 U·mL-1，为FG-69 的2.2 倍。酶活力不断达到高峰后恢复至稳定，酶活力始终维持在19 U·mL-1。而FG-19 的过氧化物酶类最高酶活力虽然达到21.87 U·mL-1，但FG-19 的漆酶活力明显小于FG-22。因此，综合以上结果，菌株FG-22 具有较高的产木质素降解酶的综合能力。

2.4 菌株FG-22 的鉴定

2.4.1 形态学鉴定 菌株FG-22 的鉴定：FG-22 菌株在平板上快速呈现出菌落特征，菌落呈白色、圆形，菌落成长较快，在平板培养7～9 d 就覆盖平板，菌落新生长区的菌丝分布均匀，呈分散、有序的絮状，菌落，表面较为平滑，新生长的菌丝无色，呈节状分隔。

2.4.2 菌株FG-22 的rDNAITS 区PCR 扩增结果 根据分子生物学的测序结果，所测得的序列如下所示：

AGTTGTACTGCGGAGACATTAACGAGTTTTGAACGAGTTGTAGCTGGCCTTCCGGGGCATGTGCACGCTCTGCTCATCCACTCTACCCCTGTGCACTTACTGTAGGTTGGCGTGGGCTCCTTTGCGGGAGCATTCTGCCGGCCTATGTATACTACAAACACTTTAAAGTATCAGAATGTAAACGCGTCTAACGCATCTATAATACAACTTTTAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGAATTCTCAACTTATAAATCCTTGTGATCTATAAGCTTGGACTTGGAGGCTTGCTGGCCCTTGTTGGTCGGCTCCTCTTGAATGCATTGGCTCGATTCCGTACGGATCGGCTCTCAGTGTGATAATTGTCTACGCTGTGACCGTGAAGTGTTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCCATTAGGACAACTTTTTAACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAACTGCGAGTGAAGCGGGAAAAGCTCAAATTTAAAATCTGGCGGTCTTTGGCCGTCCGAGTTGTAGTCTGGAGAAGCGTCTTCCGCGCTGGACCGTGTACAAGTCTCCTGA

2.4.3 系统发育树 利用MEGA 软件构建系统发育树（图4），通过基因序列相似性对比和系统进化发育分析，菌株FG-22 与接收号为AY840585（Trametes versicolor）的ITS 序列最为接近，相似度达到98%，结合FG-22 菌落的形态特征，初步确定FG-22 属多孔科、云芝属的杂色云芝（Trametes versicolor）。

图4 基于菌株FG-22 及来自GenBank 的ITS 序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic trees based on FG-22 fungi and ITS sequences from GenBank

3 结论与讨论

3.1 通过平板划线法对49 份腐烂的竹材样品中分离纯化得到74 株真菌，并对74 株真菌进行木质素降解筛选，经过PDA-愈创木酚平板变色初筛得到19 株变色明显的菌株，并对这19 株进行PDA-苯胺蓝退色筛选，其中FG-19、FG-22、FG-45、FG-694 株菌退色较为明显，并对这4 株菌进行酶活力测定复筛，通过酶活力测定发现菌株FG-22 具有较好的降解木质素的综合酶活力。

3.2 通过对FG-22 进行菌落形态和构建系统发育树等分子生物学鉴定，确定FG-22 菌株属多孔科、云芝属的杂色云芝（Trametes versicolor）。

3.3 自然界中，木质素的降解主要是通过真菌、细菌和微生物的共同作用，其中真菌在降解木质素中扮演着非常重要的作用，而研究者也将研究的重点侧重于真菌对木质素的降解，目前，研究较多的有黄孢原毛平革菌、变色栓菌、烟管菌、彩绒革盖菌等白腐菌[15]。而文章通过从天然腐烂的竹材中新分离筛选得到一株新的木质素降解菌——杂色云芝（Trametes versicolor），对竹材木质素的降解更有效，为竹材木质素降解的进一步研究提供借鉴和参考。