刘 琳 门婷婷 张文凤 张建棣 米 佳 杨春华

1 滨州医学院药学院 山东 烟台 264003；2 滨州医学院护理学院；3 烟台载通生物技术有限公司； 4 滨州医学院医药研究中心

蛋白质免疫印迹技术(western blot，WB)从发明以来已有40余年，至今为止依然是最传统且应用最广的一种蛋白质表达水平检测技术[1-2]。但是其实验步骤复杂，一次性处理样品能力有限，所得结果只能进行半定量分析，因而限制了其在高通量样本蛋白质表达水平检测中的应用。斑点印迹分析法(dot blot analysis)通过简化实验流程，可以完成高通量样本蛋白质表达水平的检测，但是实验结果依然只能以半定量形式体现。酶联免疫吸附实验(ELISA)方法虽然可以完成高通量样品中蛋白表达水平的快速检测，但是由于ELISA是个级联放大的过程，实验结果容易出现假阳性，造成实验误差[3-4]。

为了解决以上问题，我们在传统的斑点印迹分析法的基础上，研发了全新的定量斑点印迹分析(quantitative dot blot analysis，QDB analysis)方法[5-6]。在斑点印迹法中，若想对蛋白表达水平进行定量，需通过额外的图像转换过程实现对每个斑点的半定量分析。我们通过引入一种全新的96孔单元板用于QDB analysis，结合酶标仪实现了对单个斑点的直接定量检测，而不需额外的图像转换过程，即可快速实现对高通量样本蛋白表达水平的半定量分析。如果在实验过程中采用标准蛋白作为对照而引入蛋白表达水平的标准曲线，还能够实现蛋白质表达水平的绝对定量(即样品中蛋白的真正表达水平)分析。

本研究采用了QDB analysis技术分别检测了87只小鼠前列腺组织，以及8种人细胞系中管家蛋白tubulin的表达水平，结果表明，QDB analysis技术可应用于高通量样本蛋白质表达水平的定量检测，能够得到可靠的结果，具有很高的实验效率，能显著节约研究资源和工作时间，并且能够将现有的半定量免疫印迹方法转变为真正的定量分析方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材 BCA蛋白浓度检测试剂盒，ECL发光检测试剂盒为美国赛默飞公司产品。兔抗tubulin 抗体(YT-0183)购自于Imunoway公司。tubulin重组蛋白为武汉华美达公司产品。QDB板由烟台载通生物技术有限公司提供。

1.2 前列腺癌小鼠和野生小鼠 雄性8周龄前列腺癌(transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate，TRAMP)小鼠和野生(wild type，WT)小鼠购自美国Jackson实验室[7]。小鼠饲养于SPF环境，并进行交配繁殖，雄性子代经PCR基因型鉴定后，鉴定结果阳性者为TRAMP小鼠，鉴定结果阴性者为WT小鼠，将TRAMP小鼠和WT小鼠分笼饲养，6只/笼饲养于独立通风换气笼盒(IVC)内，标准饲料，温度为(23±2)℃。给予12 h光照、自由饮食饮水。

1.3 细胞培养 人细胞系HepG2、Hela、SGC-7901、MCF-7、LnCap、 W40、A549和293T购自于ATCC或者中国科学院上海细胞库。使用DMEM培养基添加10%胎牛血清，在细胞培养箱中于5% CO2，37℃条件下进行培养。

1.4 组织和细胞蛋白质提取 分离小鼠前列腺组织，将组织样品在200 μL裂解液(7 M尿素，2 M硫脲，4% CHAPS，65 mM二硫苏糖醇，40 mM Tris以及蛋白酶抑制剂)中用外科剪刀剪碎，使用组织匀浆仪匀浆1 min， 8 000×g离心5 min，收集上清。将细胞收集在裂解缓冲液中，使用移液器上下混匀20次，在4℃孵育30 min，8 000×g离心5 min，收集上清。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，用于后续分析。

1.5 WB 配制10%的SDS-PAGE胶，每孔上样10 μg蛋白样品，80～120 V进行跑胶；采用100 V，60 min将蛋白转移至PVDF膜；洗膜，5% 脱脂牛奶封闭40 min；孵育一抗(1∶2 000)，4℃过夜；PBS清洗3次，每次5 min；孵育二抗(1∶3 000)，室温下1 h；PBS清洗3次，每次5 min；在膜上滴加ECL发光液后检测。

1.6 QDB analysis技术 在蛋白提取液中加入5×SDS loading buffer，再加入DTT 至终浓度50 mM，煮沸5 min。将QDB 板悬空放置于合适的支架上。将样品按照等体积(1～3 μL)方式滴加在QDB 板单元孔底部膜的中心位置，同时以等量的BSA蛋白样品作为对照，每个样品重复3次。QDB板于37℃干燥15 min，放入底部平整的空盒中，加入适量transfer buffer(没过板底部的膜即可)轻轻晃动，充分湿润。将transfer buffer倒出，倒入TBST(没过板底部的膜即可)，室温摇床上洗5 min。将TBST倒出，倒入5%脱脂奶粉进行封闭，室温摇床上封闭1 h。放入底部平整的空盒中，加入TBST，反复晃动将管壁上可能沾染的抗体洗去，弃掉清洗液将QDB板放入干净96孔板(QDB板底部为开放性，需完全放入96孔板里，与96孔板共用每个孔)，每孔加入一抗100 μL，室温摇床孵育2 h。将QDB 板放入底部平整的空盒中，加入TBST，反复晃动将管壁上可能沾染的抗体洗去，弃掉清洗入空盒，再在空盒中加入TBST，室温摇床洗涤3次，每次5 min。将QDB 板放入干净96 孔板，每孔加入100 μL二抗，室温摇床孵育1 h。将QDB 板放入空盒，再在空盒中加入TBST，摇床上室温洗涤3 次，每次5 min。在一干净96 孔板中每孔加入100 μL ECL 发光液备用。从空盒中取出QDB板，并轻轻甩去除多余的TBST。将QDB板放入已加入ECL发光液的96 孔板，选择带盖读盘模式于酶标仪中检测发光强度。

2 结果

2.1 QDB analysis技术对小鼠前列腺组织中tubulin蛋白表达水平的相对定量检测

2.1.1 小鼠组织中tubulin抗体特异性的检测与线性相关性分析 分别取12周龄、16～18周龄、20～30周龄的WT小鼠和TRAMP小鼠各1只，取其前列腺组织，将所有小鼠的前列腺组织混合在一起，提取蛋白质，进行WB跑胶后，使用tubulin抗体进行免疫分析。实验结果如图1A所示，可见结果中有且只有1条条带，条带对照marker与tubulin分子量大小相吻合， 证明所使用的tubulin抗体具有非常良好的特异性。

将所获得的混合蛋白提取物依据不同的上样量(混合蛋白提取物上样品分别为0.1、0.25、0.5、1、1.5、3、6 μg，并用BSA将总蛋白上样量补齐为6 μg)，滴加在QDB板的核心部位，经QDB analysis技术检测分析获得化学发光强度，以混合蛋白提取物上样量为横坐标，化学发光强度为纵坐标作图(图1B)。酶标仪所读取的化学发光强度与混合蛋白提取物上样量有良好的线性关系，其相关系数R为0.993 7，由于实验中所使用的抗体仅识别混合物中的tubulin蛋白，因此，实验所得化学发光强度的大小即可表示混合蛋白提取物中tubulin蛋白含量的多少，即QDB analysis技术将组织中的tubulin蛋白表达水平转化为可以直接读取的定量数值。

A.WB检测小鼠前列腺组织中的tubulin蛋白表达，其中BSA泳道为对照组；B.QDB技术分析混合蛋白提取物上样量与化学发光强度值的线性相关性。
图1 小鼠前列腺组织tubulin抗体特异性的检测及线性相关性的分析

2.1.2 WT和TRAMP小鼠中tubulin蛋白表达水平的定量检测 分别取12周龄(19只)、16～18周龄(13只)、20～30周龄(8只)的WT小鼠以及12周龄(19只)、16～18周龄(18只)、20～30周龄(10只)TRAMP小鼠共87只。分离小鼠的前列腺组织，提取组织蛋白，使用QDB analysis技术检测每只小鼠前列腺组织中tubulin蛋白的表达水平。所有小鼠前列腺组织中tubulin蛋白的表达水平见图2A。按照不同周龄区间对小鼠前列腺组织中tubulin蛋白的表达水平进行统计学分析，见图2B。结果显示，不管是WT小鼠还是TRAMP小鼠的前列腺组织中tubulin蛋白表达水平都随着年龄增加而增加，其中WT小鼠周龄达到20～30周后，其前列腺组织中tubulin蛋白的表达水平与12周龄小鼠比较，差异具有统计学意义；而TRAMP小鼠周龄达到16～18周以后，其前列腺组织中tubulin蛋白的表达水平便与12周龄小鼠比较，差异具有统计学意义。

A. 87只小鼠前列腺组织中的tubulin蛋白表达水平；B. 12周龄、16～18周龄、20～30周龄小鼠前列腺组织中tubulin蛋白的平均表达 水平统计学结果。与12周龄相比，***P<0.001。
图2 QDB analysis技术定量检测小鼠前列腺组织中的tubulin蛋白表达水平

2.2 QDB analysis技术对人细胞系中tubulin蛋白表达水平的绝对定量检测

2.2.1 tubulin抗体特异性的检测与线性相关性分析 分别收集105个HepG2、Hela、 SGC-7901、MCF-7、LnCap、 SW40、A549和293T细胞，并混合在一起，提取混合细胞蛋白后，进行WB跑胶，使用tubulin抗体进行免疫印迹分析。结果如图3A所示，可见结果中有且只有1条条带，条带对照marker与tubulin分子量大小相吻合， 证明所使用的tubulin抗体对于人细胞样品具有非常良好的特异性。

与“2.1.1”中实验相类似，通过QDB analysis技术检测混合细胞蛋白提取物上样量与化学发光强度之间的线性相关性。结果如图3B所示，酶标仪所读取的化学发光强度与混合细胞蛋白提取物上样量有良好的线性关系，其相关系数R为0.9931。即QDB analysis技术将细胞中的tubulin蛋白含量转化为可直接读取的定量数值。但是该方法所得到的定量数值只可应用于tubulin蛋白表达水平的相对定量，而无法体现细胞中所含有的tubulin蛋白的绝对定量表达水平。

A. WB检测混合细胞提取物中的tubulin蛋白表达，其中BSA泳道为对照组；B. QDB analysis技术分析混合细胞蛋白提取物上样量与化学发光强度的线性相关性。
图3 人细胞系中tubulin抗体特异性的检测及线性相关性的分析

2.2.2 tubulin蛋白表达水平标准曲线的测定 为了完成tubulin蛋白表达水平的绝对定量，需要引入tubulin蛋白的标准曲线。将tubulin重组蛋白依据不同的上样量滴加在QDB板的核心部位，经QDB analysis检测后获得化学发光强度，以重组蛋白的上样量为横坐标，化学发光强度为纵坐标作图，得图4。酶标仪所读取的化学发光强度与tubulin重组蛋白上样量有良好的线性关系，其相关系数R为0.9937。通过该标准曲线，只要获得样品的化学发光数值，即可拟合出样品中所含有tubulin蛋白的绝对含量。例如，所检测样品的化学发光值为5×106，从tubulin蛋白的标准曲线即可对应得到上样样品中tubulin蛋白的含量为33.78 ng。

2.2.3 人细胞系中tubulin蛋白表达水平的绝对定量检测 利用“2.2.2”中获得的tubulin蛋白标准曲线，即可将QDB analysis方法所检测到的不同细胞提取物产生的化学发光强度转换为样品中tubulin蛋白的绝对表达水平，如图5A所示。以HepG2细胞为例，可知每1 μg细胞提取物中即含有tubulin蛋白110 fmol。因所收获细胞的数量已知，也可以进一步计算出每个细胞中tubulin蛋白的含量，如图5B所示。

A. QDB analysis技术检测不同细胞提取物产生的化学发光强度转换为样品中tubulin蛋白的绝对表达水平；B. QDB analysis技术进一步计算出不同细胞系每个细胞中tubulin蛋白的含量。
图5 QDB analysis技术检测不同细胞系tubulin蛋白的绝对含量

3 讨论

在本研究中，我们采用了一种新的蛋白质表达水平定量检测技术—QDB analysis技术检测了组织和细胞中管家蛋白tubulin蛋白的表达水平。通过该技术，对87个小鼠前列腺组织样品的同步上样和检测，发现tubulin蛋白的表达水平随着小鼠年龄的增加而增加；通过引入标准蛋白曲线，发现人细胞系中tubulin蛋白的绝对表达水平在90～140 fmol/μg之间。此外，已有实验室将QDB analysis技术应用于单克隆细胞的筛选和抗体效价的测定[8-9]。QDB analysis技术解决了科研工作者在进行蛋白的表达水平分析时蛋白表达水平定量困难，高通量样本检测工作量大的难题，缩短了实验整体时间，提高了实验效率，尤其是通过引入标准曲线，将传统的半定量方法转换为绝对定量方法，有助于建立蛋白表达水平检测标准，相信未来会在临床疾病诊断、食品安全检测中得到广泛应用。