马春蕾 宋韶清

1 滨州医学院基础医学院生理学教研室 山东 烟台 264003；2 滨州医学院神经科学研究所；3 山东省医药卫生“脑中风”重点实验室

耳鸣是在外界无声源刺激情况下患者对声音的一种虚拟感知，是一种听错觉。耳鸣的患病率高，一项大规模调查显示成年人中约10.1%的人患有耳鸣，而且随着年龄的增长耳鸣的发病率逐年增高[1]。

耳部疾病、噪声损伤、神经退变、药物毒性均可导致耳鸣。在耳毒性药物中，水杨酸类抗炎药、氨基糖苷类抗生素和顺铂类抗癌药导致耳鸣的发生率最高。耳鸣可以间歇性发作，也可长期持续存在。长期持续高响度的耳鸣可使患者极度痛苦，如失眠、记忆力下降、焦虑、抑郁，甚至自杀[2-5]。过去认为，耳鸣是由听觉感受部位的病变如耳蜗听觉毛细胞受损，或听神经的病变导致的[6-7]，但是切断听神经之后耳鸣不能消失[8]。近来发现耳鸣个体的听觉中枢处于高兴奋状态，以至使听觉过敏[9-10]。长时间的耳鸣可以改变听觉中枢以及相关脑部的功能状态[11]。

临床上常使用钠离子通道抑制剂如利多卡因、天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)抑制剂、苯二氮卓类药物如安定、噪声掩蔽等方法治疗耳鸣，但疗效均不理想。我们最近的研究发现，羟基红花黄色素A(hydroxysafflor Yellow A，HSYA)能够有效地缓解水杨酸钠引发的小鼠耳鸣，发挥防治耳鸣的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物治疗 采用出生后7～8周听力正常的C57BL/6雄性小鼠，利用听觉惊跳(acoustic startle，AS)反应配以前间隙抑制听觉惊跳反应(gap pre-pulse inhibition of the acoustic startle，GPIAS)筛选出无耳鸣的小鼠。选取24只小鼠随机分成3组，每组8只。第1组给予生理盐水(normal saline，NS)0.4 mL腹腔注射；第2组给予水杨酸钠(sodium salicylate，SS)(400 mg/kg)溶于NS 0.4 mL腹腔注射；第3组给予SS(400 mg/kg)联合HSYA(20 mg/kg)溶于NS 0.4 mL腹腔注射，每日1次，连续3 d。完成最后一次给药2 h后再次进行AS反应测试耳鸣发生情况。

1.2 行为学检测 AS反应配以GPIAS反应(TDT，RZ6，美国)是检测耳鸣是否存在的行为学实验。其实验原理是根据听觉功能正常的动物在突然听到很大的惊吓声音(115 dB)时反射性产生惊跳，这一现象被称为AS反应。当实验动物在接受持续的较低响度和不同频率的窄带噪声(60 dB，SPL背景噪声)刺激过程中嵌入一段无声的间隙(gap)时，听觉功能正常的小鼠能够感知这一无声间隙的出现因而产生警觉，对其后跟随而来的较大声音(115 dB，SPL)产生的惊跳反应的幅度会大大地减小。但是，耳鸣小鼠，尤其是耳鸣的频率与背景噪声的频率一致时，小鼠因自身耳鸣的存在不能辨别出gap的存在因而不会产生警觉，对随后的较大的刺激声音仍然产生很大幅度的惊跳。利用一个没有嵌入无声间隙的背景噪声(no gap)和一个嵌入无声间隙的背景噪声(gap)作为背景刺激声音的配对实验所获得的小鼠AS反应幅度之比来判断小鼠是否存在耳鸣。实验中所给予的背景噪声分别为8和16 kHz窄带噪声，带宽为1 kHz，以了解耳鸣发生的频率范围。

所有小鼠在开始试验前连续3 d被放置在透明盒子中进行适应10 min。进行GPIAS实验时，将每只小鼠放置在一个位于暗室的透明盒子中，透明盒子被放置在一个灵敏的压电传感器上，其产生的电压与数字信号处理器产生的声音所引起响应的大小成正比。该平台的输出经过放大、采样、存储于计算机内，之后进行离线分析。GPIAS由100次有前间隙试验(gap试验)和100次无前间隙试验(no gap试验)组成，有前间隙试验和无前间隙试验采用随机配对法。耳鸣的程度以有前间隙的刺激所引出反应的幅度与无前间隙的刺激所引出反应的幅度之比的百分数计算(Ratio = gap/no gap×100%)。

2 结果

2.1 SS引起小鼠耳鸣样行为学改变 SS注射组小鼠在8 kHz AS反应幅度之比明显高于NS注射组的小鼠(P<0.005)。SS注射组在16 kHz AS反应幅度之比也明显高于NS注射组(P<0.005)，见表1，图1。这一结果证明，SS注射组的小鼠存在耳鸣。

2.2 HSYA可有效地防止SS引起的耳鸣 接下来，我们分析了SS联合HSYA注射组的小鼠的AS反应检测结果，发现SS联合HSYA注射组的小鼠在8 kHz AS反应幅度之比与SS组幅度相比虽然减小，但差异无统计学意义(P>0.05)。在16 kHz，SS联合HSYA注射组AS反应幅度之比较SS注射组明显降低(P<0.005)，见表1和图1。SS联合HSYA注射组在16 kHz所测得的AS反应幅度之比明显降低。这一结果提示，SS引起的小鼠耳鸣的频率可能在16 kHz附近，而HSYA能够有效地防止SS引发的小鼠耳鸣。

表1 各组AS反应幅度之比

注：与NS注射组相比，***P<0.005；与SS注射组相比，###P<0.005；n=6。

A. SS注射组小鼠在8 kHz背景噪声存在下的AS反应幅度之比较NS注射组明显提高(P<0.005)；SS联合HSYA注射组小鼠的AS反应幅度之比与单一注射SS组相比无明显差异(P>0.05)；B. 在16 kHz，SS明显提高AS反应幅度之比，而SS联合HSYA注射组小鼠AS反应幅度之比显著降低。***P<0.005。
图1 AS反应实验显示HSYA抑制或去除SS引起的耳鸣

3 讨论

使用GPIAS方法检测动物是否存在耳鸣时，实验流程简单，数据客观，还可了解耳鸣发生的频率，是一种较可靠的耳鸣检测方法。实验中我们采用GPIAS与AS相匹配的检测方法，分别给小鼠8和16 kHz的窄带噪声作为背景刺激声，可以了解小鼠耳鸣的频率范围。在小鼠耳鸣的频率与所给的背景噪声频率一致的时候，小鼠由于自己耳鸣的频率与背景噪声频率一致，就无法辨别背景噪声中是否有无声的间隙，也就不能对背景噪声的变化产生警觉，故对随后的惊吓声音的反应幅度与背景噪声中不含间隙时的AS反应幅度相比无差别，故gap/no gap AS反应幅度之比在理论上很接近，故比值接近100%。SS引起小鼠耳鸣，因此其比值大于NS注射组和SS联合HSYA注射组。

HSYA，中药红花的提取物，在脑中风动物模型显示了有效的神经保护作用[12-13]。我们先前的研究发现，HSYA能够抑制NMDAR的活动，通过抑制海马神经细胞NMDAR介导的病理性钙超载和细胞死亡而发挥神经保护作用[14]。由于耳鸣也是中枢神经细胞过度兴奋所致[15-17]，而且抑制NMDAR兴奋性可以减轻耳鸣[7,18-19]。因此，我们试用HSYA防治SS引发的小鼠耳鸣，结果显示HSYA具有极好的耳鸣防治作用。

SS注射组的小鼠产生了耳鸣，表现为gap/no gap AS反应幅度之比明显增大，甚至大于100%，其增大还可能涉及听觉过敏等复杂因素。而NS注射的小鼠无耳鸣产生，其AS反应幅度之比远小于100%。在SS联合HSYA注射的小鼠，因SS致耳鸣的作用被HSYA极大地削弱，故其AS反应幅度之比较单一SS注射组明显减小。反之，该比值的减小也证明HSYA能够防止SS引发耳鸣。

综上所述，利用AS反应和前刺激抑制的原理，我们验证了SS能够可靠地引发小鼠耳鸣。SS和HSYA一并注射可以有效地防止小鼠耳鸣的发生。我们还发现，频率无论是在8 kHz还是在16 kHz时SS引发小鼠耳鸣均较为明显，而在16 kHz时HSYA显示有抑制SS致耳鸣的作用。这一新发现将对临床治疗耳鸣开辟新的治疗方法。