张明敏 李耀富 季达峰 吴辉群 谢童瑶 韩梦娇 吕广明△

（1 南通大学医学院人体解剖学系，2 教务处，3 医学院生物信息学系，南通 226001）

依靠计算机辅助的三维重建可视化技术，逐渐广泛地应用于医学领域[1-2]。将体视学方法与三维重建可视化技术相结合，更好地对神经科学研究的重要内容之一就是多种神经结构进行形态学研究[3]。将SD 大鼠脑干冰冻切片后进行焦油紫染色，利用软件重建出大鼠海马结构，并且可以计算重建海马各区的体积[4]。通过运用无偏体视学方法和电子显微镜技术定量研究了年龄变化对大鼠皮质、胼胝体中有髓鞘纤维的皮质体积、总体积、总长度和平均直径的影响[5-6]。师晓燕等[7]采用光学分合法建立了定量研究海马结构内神经元和突触数目的研究方法。壁虎（Gecko）隶属爬行纲、晰蝎目、晰蝎亚目、壁虎下目、壁虎科、壁虎属。常见的有多疣壁虎、无蹼壁虎、蹼趾壁虎与大壁虎。大壁虎的定位脑图谱已经构建完成及其三维重建有了初步研究[8]。而多疣壁虎（Gekko japonicus）作为再生能力很强的脊椎动物，成为神经生物学研究的模型动物[9-10]。沈宓等[11]将壁虎脊髓切片行尼氏染色，重建了壁虎脊髓颈膨大至颈3 节段。目前壁虎头颈部的整体重建未见报道，本研究分别基于尼氏（Nissl's）染色和固蓝（Luxol fast blue，LFB）染色法对壁虎头颈部和躯干作整体三维立体结构重建，并运用体视学方法对壁虎颅骨容积、全脑、端脑、大脑皮层、小脑、海马体积和脊髓颈膨大、腰骶膨大及其灰质和白质的平均面积进行定量测量，以期为壁虎脑和脊髓内实验和立体定向研究提供三维解剖学数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

正常成年多疣壁虎20 只，雌雄不限（由南通大学动物实验中心提供），体质量（4.92±0.58）g，头体长（吻端至泄殖腔的距离）为（6.57±0.10）cm。饲养在22℃～25℃、饱和湿度的空调房，自由取食黄粉虫和水。

1.2 Nissl 染色和LFB 染色

将壁虎放冰袋上冰冻麻醉，然后取头部和颈部，4%的甲醛溶液进行固定，2 d 后对标本进行梯度脱水，标本沉底后进行连续冰冻切片，片厚40μm。

将壁虎头颈部切片进行常规Nissl 染色，切片依次在下列制剂中浸没5 min：二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，100%乙醇Ⅰ，100%乙醇Ⅱ，95%乙醇，70%乙醇，在蒸馏水中浸泡后置入1%焦油紫15 ～30 min，清水漂洗。常规脱水透明，中性树脂封片。

将壁虎头躯干切片LFB 染色，先将切片放入无水乙醇：氯仿1∶1 混合溶液中8 h，然后转入95%乙醇5 min，在0.1%LFB 液56 ℃过夜，再将标本移入95%乙醇溶液5 min，转入70%乙醇 3 min，此时标本呈墨绿色，灰质、白质尚不能分清。蒸馏水清洗标本3 min，置于0.05%碳酸锂溶液中分化5 min，70%乙醇溶液分化30 s，蒸馏水洗片。镜下观察脑核团、白质边界和脊髓灰质与白质边界清晰后将标本放入双蒸水洗片。常规脱水透明，中性树脂封片。

1.3 图像摄取和二维处理

将标本依次置于Leica 光学显微镜照相系统进行拍摄，拍摄物镜为2.5 倍，目镜为10 倍。拍摄完图像后利用Photoshop 7.0 对切片进行拼接，将4 个不同区的视野拼接成1 张图片，如图1 所示。另选1 只壁虎作1 个正中纵切面，作为图像配准的参照，如图2。躯干部位的配准则以脊髓中央管中点为坐标点，如图3 所示。

1.4 三维重建

利用Photoshop 7.0 对所有图片调整和定位好后，打开3D-Doctor 4.0，导入图片，定义需要重建的结构并设定其描记的颜色。如图4 所示。对所有图片进行分割处理后，点击“3D Rendering → Surface Rendering → Simple Surface”进行表面三维重建，并对重建后的结果进行观察、切割和测量。

1.5 体视学测量

用体视学方法测量计算器官或组织体积的实现过程如图5A 所示，先将所要测量的组织等距随机切成若干片，间距为T，则第4 片组织片的体积≈组织片的，因此整个组织的体积为V=ΣAi*T。计算面积A 则用点计数法实现，如图5B 所示。点计数法就是把事先制作的关联测格叠加于切片图像上，然后记录落在切片图像上的测点数。在关联测格中，若d 为一方格的边长时，被观察物图像内的测点数为p，则观察物测面的面积为：A=d2，如图6 所示。

2 结果

2.1 三维重建

三维重建模型能够自由旋转、缩放，并从任意角度观测颅骨与头部、脑与颅骨，以及视神经与脑的结构关系，较好地反映众多复杂结构的外形和立体结构（图7）。通过重建模型可以看出壁虎的大脑表面光滑不存在沟回结构，而且壁虎小脑比较小，从重建模型中可以看到小脑在延髓上部体积较小。从重建模型中可以看出壁虎从颈到泄殖腔间有29个椎骨，脊髓充满整个椎管，也明显出现颈膨大和腰骶膨大，而且腰骶膨大比颈膨大粗大。

2.2 体视学测量

本实验运用体视学方法测量壁虎颅骨容积为（25.83±1.46）mm3，全脑体积为（19.99± 2.15）mm3，端脑体积为（7.53±0.33）mm3，一侧大脑皮层体积为（0.19±0.02）mm3，小脑体积为（0.22±0.01）mm3，海马体积（0.16±0.02）mm3，脊髓颈膨大的平均面积、灰质面积和白质面积分别为（0.70±0.02）mm2、（0.28±0.01）mm2、（0.36±0.01）mm2，颈膨大灰质与白质面积比是0.78，腰骶膨大的平均面积为（0.75±0.01）mm2，灰质面积（0.36±0.01）mm2，白质面积为（0.38±0.01）mm2，腰骶膨大灰质与白质面积比是0.95。

图1 显微镜分区拍摄后，拼接4 个视野的图像。A、C ：头部和颈部4 个视野；B、D：拼接图.Fig 1 Stitching the images of four fields after the sectorized shooting of the microscope.A，C： The four fields of view of the head and neck slices；B，D： Stitched pictures.

图2 壁虎头部的正中矢状切面。A：端脑；B：间脑；C：中脑；D：小脑；E：延髓；F：嗅脑；G：视神经；H：大脑皮层；I：冠状缝.Fig 2 The median sagittal section of the head of Gecko.A：Telencephalon；B.Diencephalon；C.Mesencephalon；D.Cerebellum；E.Medulla oblongata；F.Rhinencephalon；G.Optic nerve；H.Cerebral cortex；I.Coronal suture.

图3 X 轴和Y 轴的定位.Fig 3 Positioning of X-axis and Y-axis.

图4 体表、颅骨、脑、视神经、脊髓、灰质和椎骨的分割。A：未分割的头颈部切片图像；B：3D-Doctor 分割体表、颅骨、脑和视神经，其边缘颜色分别显示为绿色、灰色、红色和橙色；C：未分割的躯体切片图像；D：3D-Doctor 分割体表、脊髓、灰质、椎骨，其边缘颜色分别为绿色、红色、黄色和粉色.Fig 4 Segmentation of body surface，skull，brain，optic nerve，spinal cord，gray matter and vertebrae.A：An undivided image of the head and neck slice；B：The 3D-Doctor partitions of the body surface，the skull，the brain and the optic nerve，and its boundary color was shown as green，gray，red and orange，respectively；C：An undivided slice image of the body；D：3D-Doctor partitions of the body surface，spinal cord，gray matter，and vertebrae，and its boundary color was shown as green，red，yellow，and pink.

图5 组织等距切片和面积测量。A：组织等距切片；B：点计算法计算切片面积.Fig 5 Tissue isometric slice and area measurement.A：Tissue isometric slices；B：Slice area was calculated by point calculation method.

图6 点计数测格测量切片面积。A：本实验所用测点系统。B：测点系统测量颅腔、脑、新皮质和端脑切片面积示意图；①：端脑；②：大脑皮质。C：测量海马切片面积示意图；③：海马。D：测量脊髓和灰质面积示意图.Fig 6 Point counting grid to measure the slice area.A：The measurement point system in this experiment.B：The measurement of the area of cranial cavity，brain，neocortex；①：Telencephalon；②：Cerebral cortex.C：The measurement of the area of hippocampus；③：Hippocampus.D：The measurement of the area of spinal cord and gray matter.

3 讨论

神经系统或神经系统中某些结构的三维重建，为神经示踪实验提供直观、准确的空间解剖定位，进一步理解脑的特定部位的功能[12]。利用 3D-Doctor 软件对大鼠脑干连续冰冻切片进行三维重建，观察一氧化氮合酶阳性神经核团在脑干中的三维分布[13]。临床上将CT 扫描所得的DICOM 数据，运用3D-slicer 建立脑内血肿及颅骨等结构关系的三维模型，设计虚拟手术路（测定穿刺角度及深度），可显著提高对血肿中心区穿刺置[14]。

本研究在三维重建过程中需要考虑到一个重要影响因素是连续图片之间的配准，配准即确定图像像素点在空间的位置，从而将二维图像合成三维图像，图片间配准是否准确，一致直接影响重建的效果。目前解决的方法主要是利用外配准和内配准的方法[15]，外配准法一般是在制作切片前，用各种方法在组织块上或附近作标记来进行定位，通常是利用细针、激光或微电极穿孔。内配准法是指根据生物组织的解剖学特点，在切片图像中寻找特定的定位结构来进行定位。在本实验用观察纵切面并结合内配准法对图像进行配准，取得较理想的结果。因此，本次实验结果基本能呈现活体脑组织原有结构和位置。由于本实验是对颅骨、脑、视神经、外耳道、躯体、椎骨、脊髓和灰质进行三维重建，这些结构在切片上边缘清晰连贯，所以在图像分割上并不用费力，只要耐心将需要重建的结构用不同颜色线条勾勒出来即可。

本研究用体视学的方法对壁虎的大脑皮层和海马体积进行测量，对于了解爬行动物行为、神经系统进化，尤其大脑的进化有着重要的意义[16]。本研究结果显示，壁虎脊髓腰骶膨大比颈膨大的平均横截面面积要大，另外腰骶膨大的灰、白质面积比是0.95，而颈膨大的灰、白质面积比是0.78，说明腰骶膨大的灰质与白质面积基本相等，而脊髓颈膨大中灰质面积比白质明显小。

本实验对多疣壁虎头颈部连续Nissl 染色切片和头躯干整体连续LFB 染色切片成功重建出壁虎的头颈部、颅骨、全脑、视神经、椎骨、脊髓的三维模型，同时反映出壁虎脑结构和颅骨的空间位置关系，为壁虎脑内实验和立体定向提供了三维解剖学依据。