戴研平 高晓勤 秦海霞

（1 贵州医科大学基础医学院病理学与病理生理学教研室，贵阳 550004；2 遵义医药高等专科学校基础医学院，遵义 563006；3 岳阳市岳阳楼区人民医院，岳阳 414000；4 乌兰察布医学高等专科学校人体 解剖学与组织学胚胎学教研室，乌兰察布 012000）

近年来关于砷毒性在雄性生殖方面的研究越来越多。砷能大量积累在睾丸，通过血睾屏障对男性生殖细胞产生损害[1-2]。水通道蛋白（aquaporin，AQP）广泛存在于原核和真核生物细胞膜上，是选择性高效转运水分子的特异通道，在维持机体水分子平衡和内环境稳态中发挥重要作用[3]。AQP9 主要表达在间质细胞、输出小管的上皮及附睾头部[4]，睾酮可以下调AQP9 的表达[5]。AQP9 被认为在调节砷的入胞中扮演了重要角色[6-8]，过量的砷可损伤生精细胞和精子[9-10]。AQP9是砷进入细胞的主要通道，这些通道蛋白的表达水平直接关联着砷在细胞内的蓄积和毒性。目前关于不同浓度砷对睾丸中水通道蛋白的影响少有报道，阐明砷对水通道蛋白的影响，对于砷的防治或临床应用具有重要意义。本研究通过建立亚慢性砷中毒大鼠模型，探讨砷致生殖系统损害的机制和途径，进而寻找控制砷生殖毒性的分子靶点。

1 材料和方法

1.1 动物分组及模型建立

健康清洁级雄性SD 大 鼠40 只，体质量160～200 g，由贵州医科大学实验动物中心提供。结合相关文献及本课题组的前期研究[11-12]，SD大鼠随机分为低（0.4 mg·kg-1·d-1）、中（2.0 mg·kg-1·d-1）、高（10.0 mg·kg-1·d-1）剂量砷染毒组和对照（蒸馏水）组，每组10 只，采用经口自由饮用方式进行连续染毒14 周。

1.2 主要试剂

亚砷酸钠（分析纯，北京化工厂）；AQP9 兔抗鼠多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3 标本采集

大鼠乙醚麻醉，立即暴露双侧睾丸沿横轴剪为两半，经Bouin 液固定24 h 后，制作成4～7 μm的睾丸组织石蜡切片，右侧用于免疫组织化学显色，左侧用于H-E 染色。

1.4 血浆及睾丸中砷浓度测定

砷浓度采用电感耦合等离子体发射光谱仪测定（ICP 法），由贵州医科大学公共卫生学院分析测试中心完成检测。

1.5 睾丸组织中AQP9 的表达检测

右侧睾丸切片脱蜡，下行至水；进行抗原修复5 min×3 次；消除内源性过氧化物酶活性（3 %过氧化氢5 min）；正常血清室温湿盒内孵育20 min，甩掉血清，不洗；滴加适当稀释的AQP9 抗体，4 ℃孵育过一夜；室温复温0.5 h；加羊抗兔IgG 抗体-HRP 多聚体二抗，室温20 min。DAB 显色，在显微镜下控制显色程度；苏木精复染20 s，酸乙醇分色，氨乙醇蓝化，95 %乙醇脱水，切片放入 37 ℃烤箱30 min；二甲苯透明0.5 h，中性树胶封片。

采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统对大鼠睾丸阳性细胞进行半定量分析，每组随机选取3 张，40 倍目镜下连续观察5 个视野，计算平均灰度值。

1.6 ELISA 法测血清中睾酮的浓度

大鼠股动脉采血，EP 管收集血液标本，3000 r/min（半径10 cm）离心8 min，取上清液后，保存于-20 ℃冰箱，备送贵州医科大学中心实验室用ELISA 法测血清睾酮的浓度。

1.7 HE 染色观察睾丸组织一般形态

切片常规脱蜡至水；苏木精室温下染色约 15 min，酸乙醇脱色；氨乙醇蓝化；室温下染伊红2～3 min；上行脱水、透明；中性树胶封片。

1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析。实验数据以±s表示。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血浆砷及睾丸砷浓度

随着染毒组染砷剂量增加，血浆砷浓度逐渐升高，中、高剂量组与对照组之间的浓度差异有统计学意义（P＜0.05），低剂量组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。睾丸砷浓度逐渐升高，低、中和高剂量组与对照组之间的浓度差异有统计学意义（P＜0.05），低剂量组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 各组大鼠血浆砷及睾丸砷平均浓度（n=10，±s）Tab 1 Arsenic concentration in plasma and testis of rats in each group（n=10，±s）

表1 各组大鼠血浆砷及睾丸砷平均浓度（n=10，±s）Tab 1 Arsenic concentration in plasma and testis of rats in each group（n=10，±s）

*P＜0.05 vs control group

Group Plasma（mg/L）Testis（μg /g dry weight）Control group 0.0613±0.0186 1.3470±0.1682 Low-dose group 0.0740±0.0212 1.5080±0.1234*Middle-dose group 0.1080±0.0323* 1.5810±0.1426*High-dose group 0.1640±0.0375* 1.7200±0.1627*

2.2 大鼠睾丸组织中AQP9 表达

光镜下，各组大鼠均可见到AQP9 免疫阳性产物表达在睾丸间质细胞的细胞膜上，呈棕黄色或棕褐色。中、高剂量染砷组大鼠睾丸间质细胞AQP9阳性细胞数与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。低、中、高染砷组大鼠睾丸间质细胞AQP9 阳性细胞平均灰度值与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，表2，图1）。

表2 各组大鼠睾丸间质细胞AQP9 阳性细胞数 和平均灰度值（n=10，±s）Tab 2 AQP9 positive cell counts and mean grey value of Leydig cells in each group（n=10，±s）

表2 各组大鼠睾丸间质细胞AQP9 阳性细胞数 和平均灰度值（n=10，±s）Tab 2 AQP9 positive cell counts and mean grey value of Leydig cells in each group（n=10，±s）

*P＜0.05 vs control group

Group Number of positive cells（number/field）Average grey value Control group 4.40±1.65 119.80±6.46 Low-dose group 5.70±1.16 122.40±5.17*Middle-dose group 8.90±1.52* 127.80±4.66*High-dose group 9.60±1.17* 135.40±6.05*

2.3 睾丸组织光镜观察

光镜下，对照组睾丸组织生精小管排列紧密，睾丸间质无渗出。低剂量组生精小管排列基本规则，睾丸间质改变不明显。中剂量组生精小管之间的间隙增大，排列不紧密，间质可见出血和渗出的细胞。高剂量组示生精上皮细胞和睾丸间质结构不完整，间质内大片弥漫的出血渗出物（图2）。

2.4 大鼠血清中睾酮的浓度检测

随着染毒组染砷剂量增加，血清睾酮浓度（pg/ml）逐渐降低，中、高剂量组血清睾酮浓度依次 为2.145 2±0.531 2、1.800 0±0.527 5，与对照组的浓度（3.082 3±0.653 0）差异有统计学意义（P＜0.05），低剂量组的浓度（2.806 9±0.415 5）与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 免疫组织化学法检测大鼠睾丸间质细胞AQP9 蛋白的表达，DAB，×400。A：对照组；B：低剂量组；C：中剂量组；D：高剂量组.Fig 1 Expression of AQP9 protein in testicular Leydig cells detected by immunohistochemistry，×400.A：Control group；B：Low-dose group；C：Middle-dose group；D：High-dose group

图2 H-E 染色观察大鼠睾丸组织病理学变化，×100。A：对照组；B：低剂量组；C：中剂量组；D：高剂量组.Fig 2 Histopathological changes of testicular tissues of rats by H-E staining，×100.A：Control group；B：Low-dose group；C：Middle-dose group；D：High-dose group

3 讨论

砷进入细胞是其发挥作用的关键步骤，阐明砷对水通道蛋白的影响对于慢性砷中毒的防治或临床应用具有重要意义[13]。自然界中的砷以3 价的无机砷毒性最高。而在哺乳动物中，AQP9 被认为在调节砷的入胞中扮演了重要角色[14-16]。研究表明AQP9 能促进As（Ⅲ）的摄取[17]。本研究结果显示，AQP9 蛋白主要表达在间质细胞的细胞膜上，随着染砷剂量的增加，AQP9 蛋白的表达升高。

睾酮主要是由睾丸内的间质细胞合成和分泌。睾酮分泌后一部分进入血液，作用于远方的靶组织，参与对行为的调节和雄性第二性征的维持；另一部分局部作用于生精上皮，参与对精子发生的调节。Miura 等[18]研究表明砷能破坏生殖细胞，对睾丸间质细胞有直接毒性，能降低睾酮的水平。本研究结果显示，随着砷浓度的增加，血清睾酮浓度下降。大多研究者认为高砷引起血清睾酮下降的原因是高砷破坏了睾丸组织结构，影响间质细胞分泌睾酮的功能。

评价某化学物质是否对精子的发生产生有害作用主要参考睾丸形态学评价和精子发生的功能评价[19]。本研究H-E染色结果显示，正常睾丸组织生精上皮内生精细胞排列紧密，间质结构正常，而中、高剂量组部分生精细胞和间质出现了损害，生精小管之间的间隙增大，间质内有出血渗出。说明砷化物可直接损害睾丸间质的毛细血管或作用于血管舒缩中枢，使血管平滑肌麻痹，毛细血管扩张，血管通透性改变[21]。一方面可导致睾丸间质有充血，渗出。另一方面，毛细血管受损，则砷可能通过血睾屏障直接作用于支持细胞，使精子生成受阻。本研究结果显示，随着染砷剂量的升高，睾丸和血浆砷浓度升高，睾丸间质细胞损害逐渐加重，睾丸间质细胞AQP9 的表达逐渐升高，血清睾酮逐渐下降。原因可能为砷通过影响睾丸间质细胞AQP9 的表达，改变了间质细胞的内环境，使睾酮分泌减少，精子发生障碍，进而导致雄性生育能力下降。

综上所述，雄性大鼠通过亚慢性的砷暴露可致血浆及睾丸砷含量增加，对AQP9的蛋白和睾酮的分泌产生影响，引起明显的睾丸组织病理性损伤，进而影响精子发生，可能是其导致男性不育的病因之一。