徐主恩 章 波 黎 荣 洪家旺 陈 亮 吴永刚

（上海市浦东医院急诊科，上海 201300）

随着科技发展和社会进步，心血管药物及器械取得突破性的进展，但心肌梗死死亡率仍然居高不下。近年来，干细胞为基础的细胞治疗成为心肌梗死研究的热点，其机制主要为旁分泌效应[1]。虽然干细胞治疗心肌梗死安全可行，但是细胞移植后在损伤区域分布的数量较少，且细胞在移植后凋亡较快，是否致瘤也不明确[2-4]。因此，寻找新的靶点和方法实施干细胞对心梗的治疗具有重要意义。外泌体是一种直径在30～120 nm 有膜结构的纳米囊泡，形成于细胞小体，并被释放到细胞外周，能够通过传递蛋白、microRNA 等介导细胞间的信号。研究报道，干细胞来源的外泌体在心保护方面作用显著，其能够抑制心肌细胞凋亡、促进新生血管生成、改善心肌梗死后功能[5-9]。但是脂肪间充质干细胞（adipose tissue-derived stromal cell，ADSCs）来源的外泌体及其对心肌梗死的治疗，却鲜有报道。本研究拟将ADSCs 来源的外泌体，通过免疫印迹和透射电镜的方法进行鉴定，并用纯化后的外泌体处理缺血缺氧24 h 后H9C2 细胞，观察其凋亡和增殖的变化，从而确定ADSCs 来源的外泌体对心肌梗死后心肌细胞的保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物和材料

3～4 周雄性SD 大鼠（50～60 g），由第二军医大学动物中心提供。培养基DMEM/F12、培养基1640 和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco 公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自上海汉恒生物公司；CCK8 试剂盒购自浙江碧云天生物公司；外泌体提取试剂盒购自上海领科生物；CD9、CD63、CD81 抗体购自美国Abcam 公司；山羊抗小鼠IgG二抗购自英国Invitrogen 公司。

1.2 ADSCs 的分离、培养

大鼠经颈椎脱臼处死后，取大鼠腹股沟处脂肪并用无菌刀片切碎成糊状，用0.15%的Ⅳ型胶原酶在37℃消化45 min，1 500 r/min 离心5 min，去除悬浮的上清液和脂肪，加入培养液：DMEM/F12+15% FBS+1% penicillin/streptomycin，将 细胞重悬，接种于75 cm2培养瓶，置入37℃含5%的CO2培养箱培养。24 h 后换液，去除未贴壁细胞。当细胞融合达80%～90%时，进行细胞1：2 传代，传至第4 代待用。

1.3 ADSCs 外泌体的提取

第4 代ADSCs 无血清无氧培养48 h，收集细胞上清液，在4℃条件下，2 000 r/min 离心20 min，除去残渣；转移至新的离心管中，加入1/3 体积的外泌体分离液；颠倒直至完全混匀，放4℃过夜。4℃过夜后可见白色浑浊形成；4℃，5 000 r/min，离心30 min 弃上清，再次重复以上离心。剩余的沉淀即为外泌体。

1.4 外泌体电镜观察

取分离纯化外泌体 8 µL，加入等体积平衡盐PBS 溶液稀释后滴加于2 mm 的载样铜网上，于室温静置1 min，用滤纸吸去多余液体，用3%（w/v）磷钨酸钠溶液（pH6.8）室温负染5 min，用双蒸水洗后室温晾干，于透射电镜下观察并拍照。

1.5 免疫印迹检测

将提取的外泌体用0.1 mol/L PBS 清洗后加Radio-Immunoprecipitation Assay（RIPA）buffer进行细胞裂解。取上清液，用Bradford 法测蛋白浓度，于100℃水中煮5 min，离心备用。制备分离胶，加样，SDS-PAGE 电泳，取出胶板进行转膜，染膜，然后用一抗CD9（1∶1 000）、CD63（1∶1 000），CD81（1∶2 000），4℃孵育过夜。二抗（1∶2 000）室温孵育2 h。取膜后TBST 漂洗，用保鲜膜包好PVDF 膜，暗室中用X 胶片感光、显影、定影。

1.6 H9C2 细胞凋亡检测

分别取24 孔板中单独培养和10 µg 外泌体处理48 h 的H9C2 细胞。用4%多聚甲醛固定10 min，用0.3% Triton X-100 通透10 min，每孔加100 µL TUNEL 检测试剂，37℃避光孵育60 min，PBS 洗涤 3 次，用DAPI 染色5 min，用PBS 洗涤3 次后置于荧光显微镜下观察。

1.7 H9C2 细胞增殖能力检测

分别取单独培养（外泌体处理0 h）和外泌体处理（20 µg/mL）24 h、48 h 和72 h 的H9C2细胞。分别经胰酶消化制成单细胞悬液，接种于 96 孔培养板中，浓度为3×103细胞/孔，待细胞贴壁后，分别用10 µg ADSC-exosome 处理，每孔加 5 µL CCK8，反应3 h 后，用酶标仪进行检测，450 nm 波长处测定96 孔板上每个孔的吸光度值（OD）。

1.8 统计学处理

以上实验均重复3 次，结果取平均值。应用SPSS18.0 统计学软件进行分析，计量数据以±s表示，两组间比较采用t检验，多组之间的差异采用单因素方差分析（one-way，ANONA）。

2 结果

2.1 ADSCs 形态特征

细胞接种24 h 后，将培养基弃掉，并反复用PBS 清洗后，可见瓶底有零星的贴壁细胞，形态呈多角形或梭形即为ADSCs。培养3 d 后，ADSCs 呈团簇状聚集生长。传代后，细胞呈长梭形，两端有较长突起，均匀分布生长。传至第4 代时，细胞纯度可达99%以上。第1 代至第4 代细胞形态变化不明显（图1）。

图1 ADSCs 形态特征，标尺=50 μmFig 1 Morphology of ADSCs，bar=50 μm

2.2 外泌体的形态和表形特征

透射电镜下ADSC 外泌体呈圆形或椭圆形，直径30～120 nm，有完整胞膜结构，内含低密度物质（图2）。免疫印迹结果证实其表达外泌体表面标志CD9、CD63 和CD81（图3）。

2.3 H9C2 细胞的凋亡检测

在缺血缺氧24 h 又经ADSCs 外泌体处理48 h之后，TUNEL 检测结果显示H9C2 细胞凋亡的数量相比于未处理组有明显的下降（图4）。在光镜下可见经过外泌体处理后的H9C2 细胞，其细胞状态相对更好。以上结果提示ADSCs 外泌体抑制缺血缺氧H9C2 细胞的凋亡。

图2 ADSCs 外泌体的透射电镜观察Fig 2 Electron micrographs of ADSCs-derived exosomes

图3 ADSCs 外泌体表达CD9、CD63、CD81 标记蛋白Fig 3 Exosomes secreted from ADSCs were identified by protein marker CD9，CD63，and CD81

2.4 H9C2 细胞的增殖检测

CCK8 检测结果提示H9C2 细胞在经过ADSCs处理24 、48 h 和72 h 后，其增殖能力相较于对照组有明显的增强（图5）。说明ADSCs 外泌体促进缺血缺氧H9C2 细胞的增殖。

3 讨论

多种干细胞可用于治疗心肌梗死、心力衰竭等心脏疾病。ADSCs 可从皮下脂肪获得，取材方法更为简单，容易被患者所接受[10]，而且受年龄影响比较小，年长患者依然可以获得活力较好的ADSCs[11-12]。脂肪干细胞的增殖能力很强，可在短时间内获得大量活力较好的细胞。ADSCs 在基础研究和临床移植中取得了较好治疗效果[13]。但是仍面临一些障碍：细胞在损伤区滞留率比较低，细胞植入体内后存活率也比较低，虽早期有一定作用，但长期保护作用却未知[14-15]。

图4 H9C2 细胞经ADSCs 外泌体处理48 h 后（图B），相比于未处理组（图A），细胞凋亡数量明显减少，bar=25 μmFig 4 The apoptosis of H9C2 cells was significantly reduced after 48 h exosomes treatment（B）with comparison to no treatment（A），bar=25 μm

图5 H9C2 细胞的增殖能力Fig 5 Proliferation of H9C2 cells

而ADSCs 外泌体既可以起到对心的保护作用，又可避免以上问题，所以成为新的研究热点。实际上，外泌体确实可以通过生长因子、趋化因子、细胞因子、转录因子、基因和RNA 起到一定作用。作为一种膜囊泡，外泌体不仅有装载大量货物的能力，但也能保护蛋白质和RNA 等物质的降解酶或化学物质[16]。而且，外泌体可以减少心肌细胞的凋亡，影响心重构，改善心肌功能。

本实验用对H9C2 细胞进行缺血缺氧的培养方式在体外建立心梗模型。ADSCs 外泌体对H9C2 细胞处理后，显示其凋亡减少，增殖能力变强。所以，ADSCs 外泌体对心肌梗死有保护作用，是治疗心肌梗死的新方法。