郭 燕，卫颖泽，陈旭东，陈亚丽，陆晓云

胰腺癌病死率在西方国家恶性肿瘤中的占比较高[1]，我国胰腺癌每年发病率和病死率也逐年上升[2]。胰腺癌在发展初期通常无症状，由于发现晚、生存率低，寻找新生物学标志物对胰腺癌的早期诊断及评估预后具有重要意义。肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1, Trap1)是热休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)家族的分子伴侣，主要定位于线粒体。目前，Trap1在结肠癌[3]、胃癌[4]及食管癌[5]中的表达及临床意义已有报道，而Trap1在胰腺癌中的表达及临床意义尚未见报道。本文通过免疫组化PV 9000两步法检测Trap1在74例胰腺癌中的表达，分析Trap1与胰腺癌临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2006年1月～2018年12月江苏省南通市肿瘤医院74例胰腺癌住院患者的癌组织及对应的癌旁正常胰腺组织和正常胰泡组织。

1.2 试剂与方法

1.2.1主要试剂 小鼠单克隆Trap1抗体(1 ∶100)、一抗稀释液、PBS及PV 9000两步法，均购自北京中杉金桥公司。

1.2.2免疫组化法 将4 μm厚的石蜡切片置于65 ℃温箱烤片中过夜，二甲苯常规脱蜡，依次经100%、95%、75%乙醇去除多余液体，蒸馏水冲洗后，切片使用枸橼酸盐缓冲液经高压修复，3% H2O2室温下孵育阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗100 μL，室温下孵育1 h，滴加100 μL反应增强液，室温下孵育20 min，滴加100 μL二抗(增强酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，室温下孵育20 min，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，中性树胶封固。为证明Trap1抗体免疫组化检测的特异性，选用Trap1蛋白强阳性染色的切片，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判读切片由两名病理科副主任及副主任以上医师独立完成，Trap1以细胞质中呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性；p53以细胞核中呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。根据阳性细胞的染色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据阳性细胞百分比计分：1%～5%为1分，5%～30%为2分，31%～60%为3分，>61%为4分。将两项得分结果相乘：0分为不表达，1～2分为低表达，3～6分为中等表达，>6分为高表达。

1.4 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，采用非参数Kruskal-Wallis检测各组间Trap1的表达差异，采用Kaplan-Meier法检测Trap1与胰腺癌患者预后的关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Trap1在胰腺癌组织中的表达Trap1在胰腺癌组织中有10例不表达、12例低表达、23例中等表达、29例高表达；在对应的癌旁正常胰腺导管组织中均不表达；在正常腺泡组织中均低表达(图1)，胰腺癌组织中Trap1的表达明显高于正常胰腺导管和腺泡组织，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

2.2 Trap1表达与胰腺癌临床病理特征的关系Trap1高表达与胰腺癌分化程度(图2)及肿瘤大小密切相关(P<0.05)；与患者年龄、性别、浸润深度、发病部位及是否有淋巴结转移、神经侵犯、脉管内癌栓无明显相关性(表2)。

①A①B①C①D②A②B②C②D②E②F图1 A.胰腺癌组织:由大小不等、不规则的异型腺体构成;B.胰腺癌组织中Trap1低表达;C.癌旁正常导管和腺泡组织:由规则的、无异型的导管和腺泡组成;D.癌旁正常导管(黑色箭头)和腺泡组织(红色箭头)中Trap1不表达和低表达,PV9000两步法 图2 A.胰腺高分化腺癌组织:由分化良好、不规则的异型腺体构成;B.Trap1在胰腺高分化腺癌组织中的低表达,PV9000两步法;C.胰腺中分化腺癌组织:由中等大小导管样结构及大小形状各异的小腺管样结构构成;D.Trap1在胰腺中分化腺癌组织中的中等表达,PV9000两步法;E.胰腺低分化腺癌组织:由密集排列的实性巢状或条索状结构和形状不规则的小腺体混合构成;F.Trap1在低分化腺癌组织中高表达,PV9000两步法

表1 胰腺癌、癌旁组织及正常胰泡组织中Trap1的表达

2.3 Trap1表达与胰腺癌患者预后的关系随访64例胰腺癌患者，存活13例，死亡51例。Trap1不表达7例，平均生存时间22.9个月。Trap1低表达12例，平均生存时间18.7个月。Trap1中表达20例，平均生存时间20个月。Trap1高表达25例，平均生存时间19.2个月。经统计分析，胰腺癌患者生存期与Trap1表达差异无显著性(P>0.05，图3)。

2.4 p53与Trap1表达的相关性p53在74例胰腺癌中均有不同程度的表达；在正常胰腺腺泡和正常胰腺导管组织中均不表达。在74例胰腺癌中，p53低表达29例，中+高表达45例。Trap1不表达和低表达22例，中+高表达52例。结果显示：p53和Trap1表达呈正相关性(P<0.05，表3)。

图3 Trap1表达与胰腺癌患者生存期的关系

表2 胰腺癌临床病理特征与Trap1表达的关系

表3 p53、Trap1表达的相关性

3 讨论

Trap1最初通过酵母双杂交筛选确定为Ⅰ型肿瘤坏死因子受体蛋白，且cDNA测序分析显示，Trap1与热休克蛋白家族成员HSP75相同，与HSP90高度相似，与细胞质HSP90具有26%相同性和45%相似性，Trap1主要定位于线粒体，故称为线粒体HSP90。Trap1可以通过调节线粒体过渡孔，维持细胞器稳态，继而成为线粒体活性氧的清道夫[6-7]。因此，研究者发现Trap1在多种肿瘤中导致抗肿瘤药物的耐受，包括卵巢癌[8]、结直肠癌[9]和乳腺癌细胞[10-11]。

Trap1在多种恶性肿瘤[3-5,12]中表达增高，且与临床病理特征有关。本组发现Trap1在74例胰腺癌中表达明显高于对应的癌旁正常导管和腺泡组织，且Trap1表达与胰腺癌分化程度呈负相关。在卵巢癌和恶性胶质瘤[3]中Trap1的表达也与肿瘤的分化程度呈负相关，而在乳腺癌[13]中Trap1表达与肿瘤的分化程度呈正相关。此外，本组发现Trap1表达与胰腺癌的大小呈正相关性。有研究发现，在甲状腺癌[12]中Trap1的表达与肿瘤大小呈正相关性，与本组结果一致。本实验表明Trap1表达水平与胰腺癌的预后无明显相关性，可能与胰腺癌的预后较差有关，胰腺癌患者存活病例数较少。在其他恶性肿瘤[3]中如肺癌、恶性胶质瘤、肾癌、结直肠癌和食管癌[5]中，Trap1的表达可作为独立预后因素，Trap1高表达提示肿瘤患者预后差。乳腺癌细胞中Trap1过表达，乳腺癌细胞侵袭能力明显下降，过表达Trap1的乳腺癌细胞株MAD-MB-231尾静脉注射入裸鼠体内，裸鼠肺内转移结节明显低于对照组，Trap1增高可以抑制乳腺癌的转移[13]，该结果表明Trap1的高表达可能提示乳腺癌患者预后较好。Trap1表达与胰腺癌预后的关系，我们将在后续实验中进一步扩大样本量进行统计分析。

p53是人类癌症中突变最频繁的基因，其突变导致细胞周期失调，进而引起增殖异常和恶性转化[14]，在胰腺癌发生过程中癌基因K-ras及抑癌基因p53、p16和DPC4/SAMD4发挥重要作用[15]。p53在大部分胰腺癌组织中均可检测到，本组采用免疫组化PV 9000两步法检测发现p53在胰腺癌中均不同程度的表达，其中中等及高表达率达60.8%，并分析p53与Trap1的相关性，结果显示两者呈正相关性，提示p53在胰腺癌中的作用可能与Trap1有关。

总之，本实验表明Trap1在胰腺癌发生中的重要作用，可作为胰腺癌诊断的分子指标。Trap1在低分化的胰腺癌中表达明显增高，有望作为治疗低分化胰腺癌的分子靶点。