杨丹丹，张心青，杨传伦，马娜娜, 李佳明

(1.黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东 滨州 256500；2.山东京博环保材料有限公司，山东 滨州 256500)

氮、磷、钾作为农作物生长发育所必需的三大营养元素，在植物的生长发育过程中发挥着极其重要的作用。有研究表明，我国有74%的耕地土壤缺磷，而且95%以上的磷以不能被植物直接吸收利用的磷酸盐形式存在于土壤中[1-2]；约有60%的耕地土壤缺钾，95%的钾以矿物钾形态存在，不能被植物直接吸收利用，土壤中少量的速效钾含量还在以很高的速度不断下降，造成土壤中速效钾的缺乏[3]。为了维持农业生产，一般通过施用磷肥、钾肥来满足植物对磷、钾素的需求。每年施用的大量磷肥、钾肥虽然能够增加农作物的产量，但却破坏了土壤结构，且容易造成环境污染[4-6]。所以，开发新的高效解磷、解钾菌株制成的微生物菌肥，释放土壤中固定的磷、钾资源，这对发展生态农业具有十分重要的意义。 微生物菌肥作为生物技术发展的产物和农业生产中的重要肥源，对作物生长和土壤环境具有重要的影响[7]。单一功能菌肥包括固氮菌菌肥、解磷菌菌肥、解钾菌菌肥和硅酸盐细菌菌肥等[8-10]，其作用机理是通过改善土壤的理化特性，提供作物所需的营养元素，改善植物对营养的吸收[11]。大量研究表明，微生物菌肥施入土壤后能改善土壤结构，增强土壤肥力，可将空气中的氮转化为栽培作物可利用的氮，将土壤中难以被利用的磷、钾元素转化为易于作物吸收的磷、钾，促进作物的生长，增强作物的抗病性,提高作物的品质和产量，同时还具有低投入，高产出，无污染的特点，能够减少氮肥量的施用，并获得与化学肥料相同的增产比率[12-4]。产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)就是一株同时具有解磷、解钾、固氮、耐盐和促进作物生长的菌株，可制成微生物菌肥，有效改善土壤团粒结构。该菌株从番茄植株根周和根际土壤中经过多重筛选获得，通过对培养条件、碳源、氮源、无机盐单因素实验及响应面实验培养基优化，提高发酵菌量，并进行30 L罐扩大培养，从而提高发酵水平，为该菌株的产业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)：保藏编号为CGMCC No.17360

1.1.2 培养基 ①固体LB斜面培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.4。②液体LB种子培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.4。③初始发酵培养基(质量分数，%)：豆粕2.0，玉米粉1.0，葡萄糖1.0，尿素0.06，玉米浆干粉0.5，蛋白胨0.05，硫酸镁0.04，磷酸二氢钾0.02，氯化钠0.02，pH 7.0～7.4。

1.1.3 仪器与设备 HS-800D恒温水槽(太仓市利达实验设备有限公司)；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；722型可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；精密pH计(上海雷磁仪器厂)；HC-2518R高速冷冻离心机(科大创新有限公司中佳分公司)；超净工作台(苏州净化公司)；Leica DM IL LED 倒置显微镜(徕卡显微系统贸易有限公司)；SPX-250B-Z型生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；30 L发酵罐(上海百伦生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 种子液制备 取斜面菌种 2 环接种于种子培养基中，37 ℃、180 r/min 培养15 h。

1.2.2 发酵培养 以2%(体积分数) 的接种量接种于发酵培养基中，37 ℃、180 r/min 培养48 h。

1.2.3 检测方法 稀释平板涂布法。

1.2.4 实验设计 ①不同培养条件对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响：分别进行不同温度、pH对雷伯氏菌发酵活菌量的影响实验。②不同碳源对产酸克雷伯氏菌发酵菌量的影响：在初始发酵培养基的基础上，选择速效碳源(1.0%的葡萄糖、蔗糖、麦芽糊精)和缓效碳源(1.0%的玉米粉、玉米淀粉、可溶性淀粉)两两组合，设计9组实验配方，摇瓶100/500 mL装液量，37 ℃，180 r/min，发酵48 h。③不同氮源对产酸克雷伯氏菌发酵菌量的影响：在初始发酵培养基的基础上，选择速效氮源(0.05%的尿素、硫酸铵、氯化铵)和缓效氮源(2%的豆粕、玉米浆干粉、黄豆饼粉)两两组合，设计9组实验配方，摇瓶100/500 mL装液量，37 ℃，180 r/min，发酵48 h。④不同无机盐对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响：分别对硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸锰进行单因素梯度实验，以优化最佳无机盐含量。⑤Plackett-Burman设计实验：在初始发酵培养基及碳源、氮源对产酸克雷伯氏菌发酵菌量的影响实验的基础上，选择黄豆饼粉、玉米粉、蔗糖、硫酸铵、氯化钠、硫酸锰、磷酸二氢钾、硫酸镁8个因子进行PB设计。⑥最陡爬坡实验：根据Plackett-Burman实验分析结果设计最陡爬坡实验，以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域[15]。⑦中心组合设计：以爬坡设计得出的实验结果为依据进行Central Composote Design设计，用软件Design Expert8.0.6 对实验进行回归分析并且进行误差分析并求得最优值，得出响应面分析结果，进而确定最佳培养条件，最后依据回归方程绘制响应面分析图。⑧30 L发酵罐扩大实验：对培养基优化的最佳配方进行30 L发酵罐扩大验证，培养条件参照摇瓶实验。

2 结果与分析

2.1 不同培养条件对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响

2.1.1 不同温度对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响 以初始发酵培养基为培养基质，摇瓶装液量100/500 mL，选择30、35、37、40 ℃为发酵温度，180 r/min发酵48 h，发酵结束后，检测活菌量，结果如图1所示，产酸克雷伯氏菌活菌量受温度影响较大，过高和过低均对活菌量有一定影响，温度为37 ℃时活菌量最高，因此37 ℃为最佳温度。

图1 不同温度对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响Fig.1 Effect of different temperature on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.1.2 不同初始pH对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响 以初始发酵培养基为培养基质，选择初始pH值分别为6.2、6.6、7.0、7.4、7.8进行产酸克雷伯氏菌发酵条件筛选，摇瓶100/500 mL装液量，37 ℃，发酵48 h，检测活菌量，结果如图2所示。该菌量在pH值6.2～7.0的范围内随着pH值的增加而增加，高于7.4则随着pH值的增加而减少，故最佳pH值为7.0～7.4。

图2 不同初始pH值对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响Fig.2 Effect of different initial pH on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.2 不同碳源对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响

如表1所示，初始发酵培养基培养的产酸克雷伯氏菌的活菌量为1.202×1010cfu/mL，添加1.0%蔗糖+1.0%玉米粉活菌量最高，为1.426×1010cfu/mL；碳源对活菌量影响由高到低依次为速效碳源蔗糖>葡萄糖>麦芽糊精；缓效碳源玉米粉>玉米淀粉>可溶性淀粉，且蔗糖和玉米粉来源广、价格低，故选择1.0%蔗糖+1.0%玉米粉作为产酸克雷伯氏菌发酵的最佳碳源。

表1 不同碳源对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响

2.3 不同氮源对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响

如表2所示，初始发酵培养基活菌量为1.202×1010cfu/mL，2.0%黄豆饼粉+0.05%硫酸铵活菌量最高，为1.383×1010cfu/mL；氮源对活菌量的影响分别为速效氮源硫酸铵>氯化铵>尿素，缓效氮源黄豆饼粉>豆粕>玉米浆干粉，故选择2.0%黄豆饼粉+0.05%硫酸铵作为产酸克雷伯氏菌发酵的最佳氮源。

2.4 不同无机盐对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响

2.4.1 硫酸镁对产酸克雷伯氏菌活菌量的影响 将初始发酵培养基中硫酸镁的含量分别设置为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%，发酵2 d后检测活菌量如图3所示，随着硫酸镁含量的逐渐增加，活菌量呈现先增加后降低的现象，硫酸镁为0.06%时，活菌量最高。

表2 不同氮源对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响

图3 硫酸镁对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响Fig.3 Effect of magnesium sulfate on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.4.2 磷酸二氢钾对产酸克雷伯氏菌活菌量的影响 将初始发酵培养基中的磷酸二氢钾含量分别设置为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%，发酵2 d，检测活菌量，如图4所示，当磷酸二氢钾含量低于0.02%时，活菌量呈下降趋势；磷酸二氢钾含量高于0.02%，活菌量未增加，故磷酸二氢钾最佳含量为0.02%。

图4 磷酸二氢钾对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响Fig.4 Effect of potassium dihydrogen phosphae on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.4.3 氯化钠对产酸克雷伯氏菌活菌量的影响 将初始发酵培养基中的氯化钠含量设置为0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%，发酵2 d，结果如图5，氯化钠含量在0.01%～0.09%区间变化时，对活菌量影响较大，活菌量先增加后降低，当氯化钠含量为0.07%时，活菌量最高。

图5 氯化钠对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响Fig.5 Effect of sodium chloride on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.4.4 硫酸锰对产酸克雷伯氏菌活菌量的影响 将初始发酵培养基中的硫酸锰含量分别设置为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%，发酵2 d，结果如图6，硫酸锰在0.01%～0.05%变化时，对活菌量影响较大，当硫酸锰含量为0.03%时，活菌量最高。

图6 硫酸锰对产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的影响Fig.6 Effect of manganese sulfate on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.5 Plackett-Burman设计实验

Plackett-Burman 设计实验见表3，每个因素取高低 2个水平。摇瓶100/500 mL装液量，37 ℃，180 r/min，发酵48 h，检测活菌量，检测结果如表4所示，采用Design Expert8.0.6软件进行分析得到最佳拟合方程：

活菌量=152.46+9.96A-0.47B+18.32C+0.81D-25.14E+1.63F-3.66 G+1.49H

分析结果可知，此模型的P值为0.0196，证明此模型显著，具有统计学意义，其决定系数为0.978 7，校正系数为0.922 0，也能说明该模型的合理性。如表5所示，各因子对产酸克雷伯氏菌发酵水平影响大小依次是E>C>A>G>F>H>D>B,即氯化钠>蔗糖>黄豆饼粉>磷酸二氢钾>硫酸锰>硫酸镁>硫酸铵>玉米粉，对产孢子有显著影响(P<0.05)的因素为氯化钠、蔗糖、黄豆饼粉。然后进行响应面分析实验，其中氯化钠是负效应，蔗糖、黄豆饼粉是正效应，其他因素的变化对产孢子影响不显著，根据各因素的影响效应进行最陡爬坡实验的设计。

表3 Plackett-Burman实验设计各因素与水平

2.6 最陡爬坡实验

通过Plackett-Burman实验分析结果可知，影响产酸克雷伯氏菌发酵活菌量的重要因子依次是氯化钠>蔗糖>黄豆饼粉，根据其正负效应进行依次增加或减小设计，氯化钠是负效应，依次减小；蔗糖、黄豆饼粉是正效应，依次增加，最陡爬坡实验设计如表6所示，摇瓶100/500 mL装液量，37 ℃，180 r/min，发酵48 h，检测实验结果可知，随着氯化钠含量逐渐减小，蔗糖、黄豆饼粉含量逐渐增大，产酸克雷伯氏菌活菌量呈先增加后减小的变化。当氯化钠为0.075%，蔗糖为 1.1%，黄豆饼粉为2.2%时，活菌量达到最高，运用中心组合设计进行下一步优化。

表4 Plackett-Burman实验设计及检测结果

表5 Plackett-Burman实验分析结果

表6 最陡爬坡实验设计

2.7 中心组合设计

以Y活菌量为响应值，以A(氯化钠)、B(蔗糖)、C(黄豆饼粉)为自变量，采用中心组合设计进一步优化实验。实验因子和水平如表7所示，摇瓶100/500 mL装液量，37 ℃，180 r/min，发酵48 h，结果如表8所示。使用Design Expert8.0.6软件对实验数据进行方差分析和二次多项回归拟合，得到多元二次回归方程：

Y=215.25+5.91A+0.66B-2.63C-0.54AB+1.26AC-0.11BC-3.36A2-7.85B2-13.44C2

回归分析见表9，结果表明，模型决定系数为0.963 1，矫正决定系数为0.929 9，存在显著差异，F值为29.01(P<0.000 1)，说明此模型高度显著，因素A、C对孢子量影响显著，而B不显著；AB、AC、BC两两交互效应不显著。

表7 Central Composote Design实验因子和水平

表8 Central Composote Design实验设计

表9 Central Composote Design的多元二次模型和变量分析

使用Design Expert8.0.6软件绘制响应面立体分析图及其等高线，考察所拟合的相应曲面的形状响应面立体图如图7～9所示。从图7～9交互影响效应的等高线图可知，三个等高线图均略呈椭圆形，说明各因素之间交互作用对活菌量有一定的影响，但不显著；响应面分析立体图则反映分别固定黄豆饼粉、蔗糖、氯化钠，另外两个因素相互变化的趋势，三个曲面的顶点即可反映活菌量最高点，所对应的含量即为最佳含量。

由模型可得当氯化钠0.080%、蔗糖1.10%、黄豆饼粉2.19%时，预测的最大响应值为2.176×1010cfu/mL。为了检验模型预测的准确性，需进行重复验证实验，摇瓶100/500 mL装液量，37 ℃，180 r/min，发酵48 h，实验进行3次，所得实际的活菌量分别为2.177×1010、2.172×1010、2.180×1010cfu/mL，平均值2.176×1010cfu/mL，比初始发酵配方活菌量提高81.1%，且该结果与预测值十分接近，可见该模型具有较高的准确性，可预测实际发酵结果。配方(质量分数)：黄豆饼粉2.19%，玉米粉1.0%，蔗糖1.10%，硫酸铵0.06%，玉米浆干粉0.5%，蛋白胨0.05%，硫酸镁0.04%，磷酸二氢钾0.02%，氯化钠0.080%，硫酸锰0.03%，pH 7.0～7.4。

图7 B蔗糖(%)-A氯化钠(%)对活菌量交互影响效应的等高线图及响应面分析立体图(C黄豆饼粉2.20%)Fig.7 Contour map and response surface analysis stereogram of interaction effect of A sodium chloride(%)-B sucrose(%) on viable biomass (C soybean cake powder 2.20%)

图8 A氯化钠(%)-C黄豆饼粉(%)对活菌量交互影响效应的等高线图及响应面分析立体图(B蔗糖1.10%)Fig.8 Contour map of interaction effect of A sodium chloride(%)-C soybean cake powder(%) on viable biomass And response surface analysis stereogram (B sucrose 1.10%)

图9 B蔗糖(%)-C黄豆饼粉(%)对活菌量交互影响效应的等高线图及响应面分析立体图(A氯化钠0.080%)Fig.9 Contour map and response surface analysis stereogram of interaction effect of B sucrose(%)-C soybean cake powder(%) on viable biomass (A sodium chloride 0.080%)

2.8 30 L发酵罐验证

对产酸克雷伯氏菌最终发酵配方进行30 L发酵罐验证，接种量5%(体积分数)，培养温度37 ℃，初始pH 7.0，发酵罐罐压0.05 Mpa，初始转速200 r/min，初始通气量10 L/min，转速最高500 r/min，通气量最高30 L/min，发酵过程控制DO≥20 mg/L，发酵周期12～18 h，根据菌种生长情况放罐，具体为溶氧回升pH回升,验证3批，活菌量分别为2.250×1010、2.270×1010、2.285×1010cfu/mL，由此可知，放大后工艺稳定，发酵水平高，可进一步发酵生产。

3 讨 论

通过单因素优化研究了培养条件、碳源、氮源、无机盐对产酸克雷伯氏菌活菌量的影响，并利用响应面分析法对影响产酸克雷伯氏菌活菌量的关键因子进行了优化，得出最佳培养基配方，通过30 L发酵罐进行扩大培养。结果表明，产酸克雷伯氏菌最佳配方为黄豆饼粉2.19%，玉米粉1.0%，蔗糖1.10%，硫酸铵0.06%，玉米浆干粉0.5%，蛋白胨0.05%，硫酸镁0.04%，磷酸二氢钾0.02%，氯化钠0.080%，硫酸锰0.03%，pH 7.0～7.4，活菌量可稳定在2.0×1010cfu/mL以上，能够满足生产要求，为产酸克雷伯氏菌微生物菌肥的应用提供技术支持。

产酸克雷伯氏菌为肠杆菌科中一类具有兼性好氧特性的革兰阴性菌，可用于生产1，3-丙二醇[16]。桂妍雯等[17]对产酸克雷伯氏菌利用甘油生产1，3-丙二醇(1，3-PD)的培养条件进行优化；任良栋等[18]通过对 4 种常见的包埋材料固定化产酸克雷伯氏菌发酵生产 1，3-丙二醇；李莉莉等[19]研究磷酸根对发酵对的影响。另外，也有部分文献研究产酸克雷伯氏菌发酵生产其他代谢产物，白雪蕊等[20]研究产酸克雷伯氏菌发酵生产产絮凝剂，傅明亮等[21]研究产酸克雷伯氏菌发酵生产酸性脲酶，崔娜娜等[22]研究该菌发酵产胞外多糖。本研究中的产酸克雷伯氏菌作为一株同时具有解磷、解钾、固氮、耐盐和促进作物生长的菌株，能够在减少肥料施用量的同时提高作物产量，并可适用于盐碱地施用。目前有关解磷、解钾、固氮等微生物菌剂的研究居多[23-25]，但多数是具有单一功能的菌株，而本研究中的产酸克雷伯氏菌则兼具以上多种功能，制成的微生物菌肥，在后期应用于生产，取得了良好的效果。

目前，关于产酸克雷伯氏菌活菌量发酵的研究尚少，本研究进行一系列的试验来提高产酸克雷伯氏菌发酵水平，为微生物菌肥的大规模生产提供参考。本研究配方中所涉及的原料仍有一定的局限性，在微生物菌肥长期的生产过程中可作进一步的优化和调整，达到提高发酵水平和降低成本的目的。