孙承文，巩 华,2，赖迎迢,2，江小燕，陈总会，陶家发,2*，林明辉*

(1.中国水产科学研究院 珠江水产研究所，广东 广州 510380;2.农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510380)

我国的水产养殖多以静水养殖为主，随着养殖生物密度、投料的增加，残饵和生物排泄量超过了池塘的自然净化能力，使池水趋于富营养化，池塘老化严重，自净与调节能力较差，病原生物大量滋生，微生态平衡也遭到破坏。芽胞杆菌(Bacillus)是一大类好氧革兰阳性菌，其中部分种属的芽胞杆菌制备成微生态制剂也称作活菌制剂、益生素，是可以直接饲喂的有益活体微生物制剂，该类制剂能够大量消耗水体中的有机质，并将其分解为小分子有机酸、 氨基酸和氨，从而改善养殖环境，为单胞藻类提供营养，使水产动物肠道pH 值降低，产生活性较强的蛋白酶和淀粉酶，促进水产动物消化生长、增加体重，具有抑制病原菌滋生，提高水产养殖动物免疫力的功能，是一种优良水质改良剂[1-6]，近年来芽胞杆菌已经被应用于水产养殖中。本研究对8株芽胞杆菌的生物学功能特性进行初步研究，为水产养殖的病害防控、养殖水环境改善提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 泥水样采自珠海、南沙等地健康养殖鱼、虾水塘。

1.1.2 培养基 ①富集培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2，去离子水定容至1 L；②分离培养基：LB培养基；③其他培养基：直链淀粉培养基、支链淀粉培养基、酪蛋白素培养基、纤维素钠培养基、果胶糖培养基均以LB培养基为基础，分别添加0.5%的直链淀粉、支链淀粉、干酪素、羧甲基纤维素钠、果胶配制而成。

1.1.3 仪器与设备 恒温生化培养箱(BPH-9042，上海一恒科学仪器有限公司)，恒温培养振荡器(ZWY-240，上海智城分析仪器制造有限公司)，恒温水浴锅(DK-8D，上海一恒科技有限公司)，高压灭菌锅(YXQ-LS-100Ⅱ、上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。

1.2 方法

1.2.1 芽胞杆菌的初筛 取少量采集的泥水样，按10%(体积分数)比例接入富集培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养18 h，于80 ℃水浴15 min，梯度稀释后涂布于LB琼脂平板，每板100 μL，37 ℃ 培养24 h后挑取不同单菌落纯化2代。

1.2.2 菌株形态及生理生化鉴定 将纯化后的菌株划线于LB琼脂平板上，观察菌落形态，同时将纯化的菌株革兰染色，显微镜观察其形态。按照《伯杰氏系统细菌学手册》(第8版)，对分离菌株进行生理生化鉴定。

1.2.3 16S rDNA全序列分析 用阳性菌细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取纯化菌株DNA，送至上海美吉生物测序。测序结果在NCBI网站进行生物序列的相似性比对，利用Mega 7.1 对比对序列构建系统发育树，确定分离菌株分类地位。

1.2.4 产酶能力试验 试验方法参考文献[7-9](略有修改)。用无菌牙签蘸取单菌落点种于酪蛋白培养基、直链与支链淀粉培养基、羧甲基纤维素钠培养基和果胶糖培养基，每个培养基点3个重复点，37 ℃ 培养24 h，分别进行酪蛋白水解试验、淀粉水解试验、纤维素水解试验和果胶糖水解试验。分别在酪蛋白培养基、直链与支链淀粉培养基中加入2 mL碘液，均匀染色1 min；在羧甲基纤维素钠培养基、果胶糖培养基中加入0.2%刚果红染液均匀染色5 min，然后用生理盐水清洗2遍，当菌落周围出现无色透明圈后，分别测量透明圈直径(D：mm)和菌落直径(d：mm)，计算透明圈直径/菌落直径(D /d)值。使用软件SPSS 19对 D /d 值数据进行统计分析，采用 LSD 法进行多重比较，试验数据以平均值±标准差表示。

1.2.5 酸性耐受性试验 将培养好的芽胞杆菌菌液0.5 mL分别加入4.5 mL pH值为3.0、4.0、5.0 的液体LB培养基中，2 h后梯度稀释涂平板，培养后进行菌落计数并计算存活率，每个试验重复3次。

1.2.6 高温耐受性试验 将培养好的芽胞杆菌菌液5 mL分别于80、90和100 ℃水浴15 min，冷却备用，以室温条件下未经水浴的芽胞杆菌菌液作为对照，进行梯度稀释涂平板，培养后进行菌落计数并计算存活率，每个试验重复3次。

1.2.7 抑菌实验 对分离鉴定的8株芽胞杆菌进行病原菌嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌抑菌试验。将病原菌涂布于LB平板，采用牛津杯法每个平板接种待测芽胞杆菌菌液30 μL，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径(mm)。

1.2.8 安全试验 选取暂养的健康草鱼和罗非鱼进行安全试验，每种菌液组草鱼、罗非鱼各1个实验组，每组试验鱼各10 尾，试验组每组鱼分别腹腔注射1种对应芽胞杆菌菌液100 μL，菌液浓度为1.0×108cfu/mL，阴性对照组鱼腹腔注射无菌生理盐水100 μL，观察鱼的生存状态，周期为7 d，记录草鱼和罗非鱼的健康存活情况。

2 结果与分析

2.1 分离菌株生理生化试验结果

菌株编号采用地名简写加数字编号，珠海分离菌株为ZHX14、ZHX15、ZHX17、ZHX18、ZHX31，其中菌株ZHX14、ZHX15菌落为白色，不透明，表面较平且干燥，菌落较小，边缘光滑，菌体呈直杆状，菌株ZHX17、ZHX18、ZHX31菌落为白色，不透明，表面隆起，菌落有黏性，边缘光滑，菌体呈直杆状。南沙分离菌株为NSX4、NSX7、NSX9，菌落均为白色，不透明，表面较平且干燥，边缘不光滑，菌体呈直杆状。生化鉴定结果见表1，V-P反应、接触酶、过氧化氢酶均呈阳性，均能发酵葡萄糖、利用淀粉、阿拉伯糖、木糖、甘露醇和明胶。8株菌株中，ZHX14、ZHX15可以利用柠檬酸盐，ZHX17、ZHX18、ZHX31吲哚反应呈阳性。

表1 8株菌株生化鉴定

2.2 菌株序列分析

以8株菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增结果进行测序，测序结果在 NCBI进行BLAST比对，结果表明，菌株NSX4、NSX7、NSX9与菌株Bacillussubtilis的序列相似性大于99%；菌株ZHX14、ZHX15与Bacilluslicheniformis的序列相似性大于99%；菌株ZHX17、ZHX18、ZHX31与Bacillusvelezensis的序列相似性大于99%。通过 MEGA7.0 软件构建系统进化树，结果显示，菌株NSX4、NSX7、NSX9与枯草芽胞杆菌亲缘关系最近，聚类为一支；菌株ZHX14、ZHX15与地衣芽胞杆菌亲缘关系最近，聚类为一支；菌株ZHX17、ZHX18、ZHX31与贝莱斯芽胞杆菌亲缘关系最近，聚类为一支，结果见图1。

图1 8株菌株 16S rDNA 系统发育分析Fig.1 16S rDNA phylogenetic analysis of 8 strains

2.3 产酶能力

采用透明圈法定性检测8株菌株产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶的能力，若有透明圈产生，说明菌株产生对应的酶。以透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值计算产酶能力，比值越大产酶能力越强。8株芽胞杆菌中，菌株ZHX17、ZHX18、ZHX31对酪蛋白、纤维素、淀粉、果胶糖水解能力显著高于其他5株菌，差异极显著(P<0.01)； 另外5株菌中，菌株NSX4、NSX7、NSX9酪蛋白的水解能力明显高于菌株ZHX14、ZHX5，而菌株ZHX14、ZHX5的支链淀粉水解能力明显高于菌株NSX4、NSX7、NSX9，差异显著(P<0.05)，5株菌的直链淀粉、纤维素、果胶糖水解能力差异不显著(P>0.05)，结果见表2。

表2 8株菌株产酶检测结果

2.4 耐受性试验

由图2可知，8株芽胞杆菌分别在pH 3.0、4.0、5.0 条件下处理2 h，其存活率均在86%以上，说明8株菌株均有较好的酸性耐受力。进一步比较8株芽胞杆菌在pH 3.0、4.0、5.0 条件下处理2 h后的存活率，发现随着pH 的升高，8株菌存活率均不同程度提高。pH 5.0处理2 h，各菌株成活率均在99%以上。pH 3.0处理2 h，ZHX14、ZHX15存活率最低仅为86%左右，而其他6株菌株存活率均大于90%。

图2 不同pH条件下8株菌株的存活率Fig.2 The livability of 8 strains under different pH

由图3可知，8株芽胞杆菌对不同温度的耐受性不同，在相同时间(15 min)内，菌株在高温条件下的存活率随温度升高显著降低。图4数据显示，80 ℃时，8株芽胞杆菌存活率相近；温度升至90 ℃时，ZHX14、ZHX15存活率最低为50%左右，而其他6株菌为60%左右；温度升至100 ℃时，8株菌的存活率均低于20%，而ZHX14、ZHX15存活率不足10%，对高温的耐受能力明显弱于其他6株菌株。

图3 不同水浴温度条件下8株菌株的存活率Fig.3 The livability of 8 strains under different temperatures

2.5 抑菌效果

抑菌试验结果见表3。3株贝莱斯芽胞杆菌对2株病原菌抑菌能力最强，其他5株菌株中仅有NSX4对维氏气单胞菌有较弱的抑菌能力。

表3 8株菌株对病原菌抑菌结果

2.6 安全试验

通过腹腔注射8株菌菌液对草鱼、罗非鱼安全性进行试验，结果表明，注射8株菌菌液的活菌数为1.0×108cfu/mL时，各试验组鱼均未出现死亡现象，解剖未发现其他病理现象，表明8株菌株对草鱼、罗非鱼是相对安全的，见表4。

表4 8株菌株对鱼类的安全性检测结果

3 讨 论

本研究对分离的8株芽胞杆菌进行了形态学观察，发现菌落形态特征差异较大。贝莱斯芽胞杆菌在LB平板上的菌落具有黏性，地衣芽胞杆菌菌落最小，枯草芽胞杆菌菌落边缘呈明显不规则状态。分子生物学测序以及系统进化树分析等一系列鉴定表明，分离的8株芽胞杆菌分别为贝莱斯芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌。

多数益生芽胞杆菌可以分泌多种消化酶类，具有水解蛋白、淀粉、纤维素、糖类等能力，可以分解动物饲料中的各种有机成分，对肠道的消化吸收具有促进作用。芽胞杆菌产酶透明圈的大小不能完全说明酶活性的高低，所以透明圈小的菌株不一定酶活性低[9-11]。可以通过促产酶培养基组分、发酵参数的优化进一步促进菌株产酶能力的释放。本研究采用平板透明圈法，对8株芽胞杆菌产酶生物学功能进行初步分析。结果显示，8株芽胞杆菌均具有一定的产酶能力，其中贝莱斯芽胞杆菌的产酶能力相对强于其他5株地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌。芽胞杆菌通过产生内生胞子增强其抗逆性，可以耐高温加工、耐储藏、耐胃酸，具有较好的稳定性，还可以胞子形式进入消化道，与肠道上的特异性结合位点结合，形成优势菌群，但不同菌株间环境耐受性存在较大差异[12]。耐酸、耐高温试验结果表明，分离的8株芽胞杆菌均具有较强的耐酸、耐高温能力。

芽胞杆菌生长代谢过程能产生多种抗菌物质，如抗菌蛋白、脂肽类抗生素等。研究表明，芽胞杆菌对病原菌具有明显的抑制作用、占位作用，以及对营养、氧气的竞争作用，从而对病原菌产生明显的生物拮抗作用[13-15]。因此，深入研究芽胞杆菌代谢抗菌物质对水产动物病原菌的拮抗作用对水产病害防控有积极的意义。抑菌试验结果表明，8株芽胞杆菌中，3株贝莱斯芽胞杆菌具有很好的病原菌抑制作用，可以作为病原拮抗菌做进一步研究。安全无毒性、无致病性是益生菌最重要的特性之一，因此益生菌在实际应用前，有必要对菌株的安全性做出评价。目前，主要通过对水产动物进行菌液注射、浸泡、口服(饲料添加)等方法，观察试验动物是否健活，解剖内脏器官有无病变，评价水产益生菌的安全性[12，16-20]。本研究结果表明，8株芽胞杆菌对特定养殖鱼类未有毒性致病现象发生，是相对安全的。后续研究中还将通过饲料添加芽胞杆菌口服的方法进一步评价其安全性。