姜 姗, 王兴亚, 王小奇

(沈阳农业大学植物保护学院, 沈阳 110161)

灰飞虱Laodelphaxstriatellus隶属于半翅目(Hemiptera)飞虱科(Delphacidae)，是我国重要的农业害虫之一，可危害水稻、麦类、玉米等多种禾本科植物，常可造成严重的经济损失(顾伯良等, 2005)。该种害虫广泛分布于东亚、东南亚、欧洲和北美等地区，尤以东亚温带地区发生危害最为严重，在我国水稻主产区普遍分布(刘向东等, 2006)。20世纪60年代，该种害虫在江苏大面积暴发，而后80年代暴发趋势蔓延到山东。近年来，随着免耕、稻套麦及麦套稻等轻型栽培技术以及感病高产品种的推广应用(邰德良等, 2005)，同时受冬季平均气温的升高以及生态环境的恶化等诸多因素的影响(吴雪芬等, 2005)，灰飞虱的发生量逐年增加。特别是近年来，由于长期大量使用化学杀虫剂，使得灰飞虱对一些药剂产生了严重抗药性，给该种害虫的防治带来更大困难(孙志广等, 2018)。

微卫星标记(microsatellite marker)，又被称为简单序列重复(simple sequence repeats, SSR)，是种群遗传学和分子生态学等研究领域的重要研究手段，具有高多态性、自然选择压力小、共显性遗传、实验重复性高、对DNA模板要求低以及突变速率高等优点而广泛应用于遗传图谱构建、克隆、农作物育种、分子标记筛选、分子谱系地理研究等领域(Jarne and Lagoda, 1996; Tangetal., 2015; Duanetal., 2017)。此外，研究物种种群遗传结构是害虫综合治理的重要内容，有助于探讨其种群间遗传进化关系，揭示其起源、扩散路线及趋势，进而为明确该种害虫的发生动态与成灾适应机制提供理论基础。

近年来，随着生物技术的进步，微卫星的开发和分型技术越来越普遍。目前，我国对于灰飞虱的种群遗传多样性、种群扩散及历史动态等方面研究已有部分报道。Hoshizaki (1997)利用同工酶技术对日本和我国台湾地区不同地理种群的灰飞虱进行遗传多态性分析，发现不同地区种群灰飞虱存在地理种群差异；万由衷等(2001)对不同地理种群的灰飞虱进行RAPD分析，将其分为两个簇，簇1包括北京、上海、福建、海南、辽宁、四川及云南种群；簇2包括宁夏和日本种群。并且不同地区灰飞虱种群的遗传距离与其地理距离不呈相关性。对云南省和江苏省中7个灰飞虱的地理种群研究表明，灰飞虱rDNA的基因间隔区(intergenic spacer, IGS)在种内存在多态性，7个灰飞虱种群未形成明显的地理种群分化(廖富荣, 2004)。利用642 bp的线粒体基因组片段对15个地理种群309头灰飞虱的测序结果进行分析，共确定16种单倍型，其中，单倍型1和单倍型2是最主要的单倍型，占整体的87.7%，不同地理种群灰飞虱遗传分化程度较小(Zhangetal., 2013)。利用线粒体基因(COI和COII)和13个SSR位点对中国22个灰飞虱地理种群进行种群遗传结构及种群遗传多样性的研究发现，整个气候区的微卫星多样性水平大致相似(Sunetal., 2015)。

本研究利用微卫星标记对中国东北地区灰飞虱不同地理种群的遗传多样性和遗传结构进行研究，以期分析中国东北地区灰飞虱种群间的遗传分化和基因流，为制定灰飞虱综合防治措施在分子生物学方面提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2012-2016年，实地采集我国东北13个市县的375头灰飞虱成虫样品(表1)，其中包括分别在2012-2014年采集沈阳3个种群。采集时每头灰飞虱成虫保持3 m以上距离，避免采集到来自同一个父母本后代个体。将收集到样品浸泡在-20℃，95%乙醇中，保存于沈阳农业大学植物保护学院。

1.2 灰飞虱基因组DNA提取

将单头试虫置于1.5 mL离心管中，加入蒸馏水多次洗涤后晾干，使用天根生化(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取灰飞虱总DNA。用NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪检测提取的灰飞虱基因组DNA浓度以及吸光度值，将检测合格的DNA样品置于-20℃冰箱内保存。

表1 中国东北地区灰飞虱采集信息及供试个体数量

1.3 微卫星位点的筛选

根据孙荆涛(2012)和Sun等(2015)的16个灰飞虱微卫星标记进行筛选，微卫星引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。经过筛选，从中选取具有多态性高，易于扩增的9个微卫星位点，引物信息列于表2。

PCR反应体系(20 μL): ddH2O 16.3 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL, 10×EasyTaq Buffer 2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, EasyTaq DNA Plymerase 0.2 μL, DNA模板0.5 μL。反应条件: 94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 53～58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共35个循环; 72℃延伸5 min, 4℃保存。PCR扩增产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况后，将目标产物送往上海生工生物技术有限公司进行毛细管电泳(STR)基因检测，最后用GeneMarker软件进行等位基因片段大小的读取，并人工进行位点数据较对。

表2 微卫星引物信息

1.4 数据分析

本研究利用GENEPOP 4.0.9(Raymond and Rousset, 1995)进行灰飞虱各个位点和种群哈迪-温伯格平衡检测及连锁不平衡检测。利用GenAlex 6.51(Peakall and Smouse, 2006)软件计算种群在各位点上的等位基因数(Na)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、非偏差期望杂合度(uHe)、Shannon信息指数(I)、F-statistics统计和基因流(Nm)，以及位点在各种群中的等位基因数、观测杂合度、期望杂合度以及Nei氏期望杂合度。并根据遗传距离矩阵进行PCoA(principal coordinates analysis)分析。使用MEGA7(Kumaretal., 2016)基于Nei氏遗传距离运用UPGMA聚类法构建系统发生树。使用Arlequin3.5.2.2(Excoffieretal., 2005)软件分析种群间遗传分化和基因流水平。 用STRUCTURE 2.3.4 (Pritchardetal., 2000)根据贝叶斯聚类的方法分析种群遗传结构，重复10 000次。使用Evanno的ΔK方法(Evannoetal., 2005)确定最佳的K值后使用CLUMPP1.1.2软件(Jakobsson and Rosenberg, 2007)对结果进比对和整合并使用Excel 2016作图。使用GeneAlex 6.51软件进行分子方差分析(AMOVA)，将15个灰飞虱地理种群作为整体，按照贝叶斯聚类结果分别进行分组，然后分别在这两种分组方式下进行AMOVA分析。

2 结果

2.1 灰飞虱种群微卫星位点的检测

通过荧光引物优化和筛选，确定了9对扩增效果较好且多态性高的微卫星位点(表2)。并按理论片段大小将9对荧光标记分为3组。使用GENEPOP 4.0.9对各位点进行哈迪-温伯格平衡检验，其结果经过Bonferroni校正，大部分位点未偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.00024)，且偏离哈迪-温伯格平衡的种群基本都表现出杂合子缺失情况(表3)。对微卫星之间的连锁不平衡性测验发现，各位点间不存在显著连锁现象(P<0.05)。

9个位点无效等位基因频率为0.021～0.127，其中位点LS1的无效等位基因频率最高为0.127，所有位点的无效等位基因频率均小于0.200。由中国东北地区15个灰飞虱地理种群在9个微卫星位点上的遗传多样性参数值(表4)可知，每个位点的平均等位基因数为20，平均观测杂合度为0.566，平均期望杂合度为0.814，平均Nei氏期望杂合度为0.813。总体上，灰飞虱各位点等位基因数较高，杂合度水平较高且近交系数低，表明遗传多样性较高。此外(表5)，各个灰飞虱种群平均等位基因数为5.511，平均有效等位基因数为3.253，平均观测杂合度为0.548，平均期望杂合度为0.582。Shannon信息指数在0.614～1.679间。其中，开原(KY)种群遗传多样性最低，普兰店(PLD)种群遗传多样性则最高。

表3 9个微卫星位点在中国东北地区各灰飞虱种群中的哈迪-温伯格平衡的检测

种群代码见表1；下同。For population code, see Table 1. The same below. 星号表示经Bonferroni校正后与哈迪温伯格平衡存在显著偏差(P<0.00024)。Asterisk indicates significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium after Bonferroni correction (P<0.00024).

表4 中国东北地区15个灰飞虱地理种群中9个微卫星位点的遗传多样性

2.2 灰飞虱种群遗传分化与基因流

通过每个位点的固定指数FIS,FIT和FST检验种群的遗传分化，各个位点的F-statistics分析结果如下。9个微卫星位点在15个灰飞虱地理种群内近交系数(FIS)在-0.223～0.367之间，群体总近交系数(FIT)范围为0.098～0.618。种群间分化系数(FST)范围为0.178～0.462。根据基因流的大小，位点LS8的基因交流程度相对较大(1

灰飞虱不同地理种群间遗传分化(FST)及基因流(Nm)研究结果表明， 各地理种群间的遗传分化指数为0.012～0.550。其中，沈阳(SY2012)和沈阳(SY2014)种群间遗传分化最小(FST=0.012)，吉林(JL)和开原(KY)种群间遗传分化最大(FST=0.550)。各地理种群间基因流Nm为0.204～20.275。其中，沈阳(SY2012)和沈阳(SY2014)种群间基因流最大(Nm=20.075)，吉林(JL)和开原(KY)种群间基因流最小(Nm=0.204)。此外，吉林(JL)种群与其他14个地理种群的基因流(Nm)均小于1，遗传分化系数(FST)均大于0.25。因此，吉林种群与其他种群存在较大的遗传分化，其他大部分种群间遗传分化不明显(表6)。

表5 中国东北地区15个灰飞虱地理种群的遗传多样性

表6 中国东北地区15个灰飞虱地理种群间成对固定系数FST(下三角)及基因流Nm(上三角)分析

*P<0.05(多重检验Multiple test).

研究结果表明，不同地理种群灰飞虱的遗传距离在0.135～2.198之间，凤城(FC)和大石桥(DSQ)种群间的遗传距离最小(0.135)，吉林(JL)种群和凤城(FC)种群间遗传距离最大(2.198)(表7)。此外，不同地理种群灰飞虱的遗传相似度为0.111～0.874，凤城(FC)和吉林(JL)种群间遗传相似度最小(0.111)，凤城(FC)和大石桥(DSQ)种群遗传相似度最大(0.874)。

表7 中国东北地区15个灰飞虱地理种群间的遗传距离(下三角)和遗传相似度(上三角)

2.3 灰飞虱地理种群遗传结构

利用UPGMA法对15个灰飞虱地理种群进行Nei氏聚类分析，在相似系数为0.80处，总共15个灰飞虱种群被两支，第一支为吉林市(JL)种群，第二支为其他种群。而在相似系数为0.70处，第二支种群又被分为沈阳种群(SY2012, SY2013和SY2014)和其他种群(图1)。

图1 中国东北地区15个灰飞虱地理种群间基于Nei氏遗传距离的UPGMA聚类图

基于遗传距离矩阵构建的PCoA结果显示，第1和第2坐标轴上SSR变异贡献率分别为43%和14%，基于贝叶斯聚类的中国东北地区灰飞虱15个地理种群也产生了类似的遗传结构(图2)，其中沈阳种群(SY2012, SY2013和SY2014)和吉林种群(JL)倾向于聚为一组，而其余种群种群聚为一组。

应用STRUCTURE 2.3.4软件对每个K值均运算10次，当K=2时(图3)，为最佳分组方式。聚类结果显示，当K=2时，吉林种群(JL)、沈阳种群(SY2012, SY2013和SY2014)和开原种群(KY)聚为一个类群，其余种群聚为一个类群(图4)。

2.4 AMOVA分子方差分析

本研究将中国东北地区灰飞虱种群作为整体进行分子方差分析(表8)，根据ΔK值将15个地理种群分为2个组，综合PCoA结果，第1组为沈阳种群(SY2012, SY2013和SY2014)和吉林种群(JL)组，第2组为其他种群组，进行分子方差分析(表8)。从总群体分析来看，不同种群间存在一定的遗传分化(FST=0.131,P<0.001)。其中，87%的遗传变异来自种群内部。变异等级分析(hierarchical AMOVA)分析结果表明，不同组之间存在明显分化，占全部遗传差异的25%， 同一区域内不同地理种群间的遗传分化占全部遗传变异的24%，另外51%遗传变异来自种群内。

图2 中国东北地区15个灰飞虱地理种群基于FST值的遗传距离矩阵的主坐标分析(PCoA)

图3 lnP(K)值变动图和ΔK方法绘制的K值变动图

图4 基于9个微卫星位点的中国东北地区灰飞虱15个地理种群的STRUCTURE聚类分析

表8 中国东北地区15个灰飞虱地理种群的AMOVA分析

2.5 遗传距离与地理距离间的相关性分析

如图5所示，对15个灰飞虱地理种群间的遗传距离与地理距离进行相关性回归分析，回归方程为y=0.0061x+0.1323(r=0.036,P=0.480)，由此可见，15个灰飞虱地理种群的遗传距离与地理距离无显著相关性。

图5 基于9个微卫星位点的中国东北地区灰飞虱15个地理种群遗传距离与地理距离间的相关性分析

3 讨论

3.1 种群遗传多样性

探究物种遗传变异有助于揭示物种起源与进化历史(Lohmanetal., 2008)。通常认为，物种具有较高的遗传变异，说明其可能更具有较强的适合环境变化的能力(Erikssonetal., 1993)。等位基因数和杂合度水平是群体内遗传变异的重要指标，同时也是微卫星位点遗传多样性指标，但等位基因数目容易受到样本量的影响(Maudetetal., 2002)，样本量的大小与等位基因数呈正相关(杨君等, 2018)。等位基因数越多，说明该位点的遗传多样性越高。观测杂合度(Ho)是一个座位的杂合子数除以观察个体总数，它与期望杂合度(He)相比，更易受样本大小等因素的影响(杨泽宇等, 2007)。Takezaki和Nei(1996)提出微卫星计算出的期望杂合度(He)在0.300～0.800之间，则可说明群体遗传多样性较高。

在本研究中，15个灰飞虱地理种群375头灰飞虱的SSR分析结果发现，9个微卫星多态性较高，平均每个位点对应15个地理种群的等位基因数介于8～45个，平均为20个(表4)。说明此9对微卫星引物在15个地理种群中所提供的多态信息含量较为丰富，遗传多样性分析结果可靠。15个地理种群的平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为0.548和0.582(表5)。各地理种群遗传多样性较高，说明了灰飞虱对环境的适应能力较强(牛成伟等, 2006)。Sun等(2012)开发了9个灰飞虱的微卫星位点，并对中国3个地理种群(江苏、山东和浙江)进行微卫星研究，结果显示这些位点具有高度多态性，每个位点对应的3个种群有13～30个等位基因。蒋欣雨(2014)开发了7个微卫星位点对3个灰飞虱种群进行种群遗传多样性的分析，得出3个种群的观察杂合度和预期杂合度分别在0.543～0.971和0.604～0.876之间。Sun等(2015)对中国24个灰飞虱地理种群进行遗传多样性分析的结果也与本研究得出结果相似，平均观测杂合度HO值为0.590～0.774，uHe值为0.752～0.810。总体上，我国东北地区不同地理种群灰飞虱具有较高的遗传多样性。

3.2 种群遗传分化与基因流

种群间固定指数FST反映了种群间的分化程度。FST越接近0，种群间越相似；越接近于1，分化越显著。本研究结果表明，不同地理种群的灰飞虱具有一定的遗传分化，各地理种群间的遗传分化系数为0.012～0.550，各地理种群间的基因流Nm为0.204～20.275(表6)，其中吉林种群(JL)与其他14个地理种群的基因流均小于1，遗传分化系数均大于0.25，说明吉林种群(JL)较其他种群有一定的遗传分化。孙荆涛(2012)对灰飞虱种群的FST结果显示总体FST为0.0036，只有东北的两个种群有较微弱的分化，这与本研究结果相似。

3.3 种群遗传结构

通过构建UPGMA系统发育树、主坐标分析(PCoA)及STRUCTURE聚类分析进行种群遗传结构分析(图1～4)，结果表明，灰飞虱具有一定的谱系遗传结构，吉林种群(JL)相对其他种群产生较为明显的遗传分化。此外，AMOVA分子方差分析表明(表8)，87%遗传变异主要发生在种群内，变异等级分析(hierarchical AMOVA)分析结果表明，不同组之间存在明显分化，同一区域内不同地理种群间的遗传分化，占全部遗传变异的24%，另外，51%遗传变异来自种群内，表明东北地区灰飞虱已存在明显的遗传分化，而灰飞虱遗传分化无一定的地域性差异，地理距离对灰飞虱遗传分化没有显著的影响。蒋欣雨(2014)利用7个微卫星位点对3个灰飞虱种群进行种群遗传多样性的分析，结果显示灰飞虱种群分化较小，但东北黑龙江两个种群与其他种群相比分化程度较高，说明东北种群发生了一定程度的遗传分化，这可能与灰飞虱种群中存在居留型导致的。这一研究现象与本研究吻合。

东北夏秋的主要风向是西南风和南风，显然不利于春季迁入的昆虫往南回迁，有可能对迁入东北的昆虫种群具有Pied pipe效应(武向文, 2001)。而国内报道灰飞虱在东北地区能够以若虫越冬(林志伟等, 2004)。利用线粒体基因(COI和COII)和13个SSR位点对中国22个灰飞虱地理种群进行种群遗传结构及种群遗传多样性的研究发现，整个气候区的微卫星多样性水平大致相似，由于线粒体基因组比核基因组更易受到影响，温带地区的线粒体多样性水平明显低于其他气候区。推测可能由于东北地区的水稻种植面积扩大使得灰飞虱大量迁移导致的遗传分化(Sunetal., 2015)。侯文杰(2013)比较了我国5个地理种群(郑州、嘉兴、沈阳、济宁、南京)中不同灰飞虱种群的生态学特性差异，从雌雄比、发育历期、有效积温等方面发现沈阳地区灰飞虱种群与其他地区种群有较大不同。从19世纪末开始，东北地区水稻种植面积从东北的东部地区开始扩大，慢慢扩大到南部地区和北部地区，这可能为迁飞的灰飞虱提供了一定的食物来源，因此东北地区灰飞虱的遗传分化可能是种群中迁飞型与居留型的分化导致。

3.4 害虫防治启示与未来工作

目前，灰飞虱广泛分布于我国各水稻主产区，该种害虫的远距离迁飞行为使得我国部分地区灰飞虱种群存在一定的基因流(Sunetal., 2015)，抗性基因随长距离迁飞而扩散，可能导致杀虫剂抗性基因的迅速传播。因此，在较大的时空范围内调查具有杀虫剂抗药性的灰飞虱种群，研究种群中抗性基因相对于遗传结构和基因流水平的分布，能够确定其对杀虫剂的抗药性水平。本研究所使用的灰飞虱样品均采自东北地区，下一步仍需对全国地区的灰飞虱种群进行样品采集，针对全国地区的灰飞虱种群进行遗传多样性及遗传结构的研究。

除了地理和气候以外，寄主植物的专化性和杀虫剂的施用也可能影响灰飞虱种群遗传变异的分布(Brévaultetal., 2008)。因此，针对同一地区灰飞虱不同年际间的种群多样性及遗传结构研究将有助于揭示灰飞虱对该地区的适应性。本文对东北地区的灰飞虱遗传多样性及遗传结构进行了研究，但由于样品采集限制，东北地区灰飞虱同一地区不同年际间的种群多样性及遗传结构尚未明确。此外，近年来以菌治虫的的思路受到广泛重视，对稻飞虱体内微生物的多样性的研究，能够为将来以菌治虫打下基础(Berasateguietal., 2016)。而针对灰飞虱在我国的种群扩散路径及种群分化历史的深入研究，对灰飞虱的预测预报具有重要作用。因此，未来为了更好地理解灰飞虱的种群历史和种群遗传结构及对其未来的扩散进行准确预测预报，还需多种手段进行进一步研究。