熊 亮，汪 燕，彭青春，马振刚

（重庆师范大学生命科学学院，重庆 沙坪坝401331）

蜜蜂微孢子虫是一种真核微生物，可引起蜜蜂患蜜蜂微粒子病。患蜜蜂微粒子病的中肠严重受损，出现爬蜂、下痢等症状，最终导致蜜蜂群势减弱，产蜜量降低，对养蜂业造成巨大经济损失。目前微粒子病在蜂群中的传播已经非常广泛，对蜜蜂微孢子虫的防治研究是蜜蜂病虫害研究的重点之一。但是从事蜜蜂微孢子虫研究的前提就是获得大量纯化的蜜蜂微孢子虫作为研究材料，因此寻找有效的蜜蜂微孢子虫提取纯化方法显得尤为重要。目前已报道的基本都是根据蔗糖密度梯度离心法、Percoll密度梯度离心法、差速离心法等方法来分离纯化微孢子虫。蜜蜂微孢子虫呈椭圆形与其他物种微孢子虫大小不一样，已报道的方法用于提取蜜蜂微孢子虫会造成大量孢子损失，因此在其基础上需要不断地进行操作优化，以收获纯净的蜜蜂微孢子虫。下面介绍一种在常规离心条件下可有效纯化蜜蜂微孢子虫的方法，可供广大蜂业科研工作者参考。

1 从匀浆液中分离蜜蜂微孢子虫

首先，收集患微粒子病的蜜蜂，取腹部。用匀浆器或研钵研磨成匀浆，匀浆加dd H2O后用4层纱布过滤，去掉滤渣，收集滤液；滤液经3 000 r/min离心5 min，留沉淀；用dd H2O将沉淀重新悬浮后再经3 000 r/min，5 min离心，收集沉淀；随后，再用dd H2O悬浮上述沉淀，300 r/min离心5 min，收集上清液；同时，用dd H2O将沉淀悬浮起来，300 r/min离心5 min，重复此步骤多次，直至上清液几乎无微孢子虫为止。最后，将上述离心收集的上清液于3 000 r/min离心5 min后，收集沉淀，并重悬于生理盐水中，存于4℃备用。

2 蜜蜂微孢子虫的纯化

Percoll原液用1.5 M的NaCl稀释为浓度25 %、50 %、75 %和100 %，做成管底到管口的浓度不断降低的不连续梯度，加入未纯化的蜜蜂微孢子虫，4℃,12 000 rpm超速离心20 min后，有白色沉淀沉积于离心管管底。去掉上清液，收集白色沉淀。白色沉淀用PBS溶液悬浮，放入1.5 mL的离心管中，3 000 r/min离心5 min。去掉上清液，刮掉沉淀上面的黑色部分，加入少量PBS溶液，吹打白色沉淀，直到底部出现黑色沉淀，收集已悬浮的液体，3 000 r/min离心5 min，即可得到较纯的蜜蜂微孢子虫沉淀。经镜检，微孢子虫均一性和折光性一致，可进行后续基因组提取、蛋白提取等实验。此方法的优点是操作简单，所需试剂和设备常见，能得到大量较纯的蜜蜂微孢子虫用于后续研究。