高 艳，朱雅楠，苏松坤，聂红毅

（福建农林大学动物科学学院[蜂学学院]，福建 福州350002）

蜜蜂具有明显的级型分化和复杂的社会分工，是适合研究社会行为进化的模式生物。蜂群成员间的劳动分工具有极强的可塑性，对于维持群势，适应环境变化等有着不可取代的作用[1-2]。工蜂劳动分工分化的哺育蜂和采集蜂不仅在群体繁衍发展方面发挥重要作用，更为人类带来巨大的经济效益。尽管蜜蜂在农业经济和生态系统服务中起着至关重要的作用，但直到20世纪初才开始在分子和生化水平上研究蜜蜂生物学[3]。哺育蜂分泌出的蜂王浆不仅对蜂群的发展至关重要，对于协调人体内各项机能的健康发展也起到不可或缺的作用。蜂王浆是仅次于蜂蜜的主要蜂产品，蜂王浆的生理生化、药理疗效功能已在国内外得到广泛的研究，同时蜂王浆产业带来了巨大的经济效益。经过多年的发展，从普通意大利蜜蜂中培育的“浙农大1号”意蜂的王浆产量高出普通意蜂的10倍以上，极大地提高了我国蜂王浆的产量，使我国成为世界上蜂王浆生产和输出的第一大国，也极大地促进了我国蜂业经济的高速发展。因此，探究蜂王浆形成的生物学机制对后期培育出更加优质高产的蜂王浆品种（蜂种）有着重要的理论意义。本文对西方蜜蜂咽下腺、上颚腺、脑的形态结构、生理功能以及现阶段分子水平等已有研究报道进行综述，以期为深入研究蜂王浆的分泌机制和培养蜂王浆优质高产的蜂种提供理论参考。

1 咽下腺

1.1 咽下腺的形态结构

蜂王浆主要由哺育蜂咽下腺和上颚腺分泌，其中咽下腺是分泌王浆的主要器官[4-5]。咽下腺位于工蜂头内部，呈葡萄串状缠绕在头部两侧，其生理功能会随着工蜂在蜂群内职务的改变而变化。目前，咽下腺发育的形态研究主要是借助显微镜及各类染色技术观察不同日龄条件下咽下腺腺泡的体积或面积。此外，超显微结构发现咽下腺的发育不仅与工蜂的日龄和行为相关，也受其他因素的影响，如蜜蜂的种系、蜂群条件、季节气候等[6]。咽下腺发育所需的蛋白主要来源于蜂群中花粉的供应[7]。

咽下腺在哺育蜂时期腺泡体积达到最大、内容物最充实，是观察腺泡形态的最佳时期[8]。在自然蜂群中，10日龄左右的哺育蜂咽下腺腺泡中大部分充满发育好的层状粗内质网，21日龄左右的采集蜂后粗内质网减少[9]。通过体视显微观察，发现浆蜂（一种从意大利蜜蜂品种中筛选出的高产蜂王浆蜂种）较普通意大利蜜蜂（以下简称意蜂）的咽下腺腺泡发育早、内容物增多，呈乳白色，分泌蜂王浆时间长[10]。共聚焦显微观察咽下腺由数千个双细胞单元组成，这些双细胞单元由分泌细胞和导管细胞组成，并且这些双细胞单元围绕长的收集管以约每12个1组排列而成[11]。Klose等人通过DAPI和鬼笔环肽染料对蛹期和刚出房意大利工蜂的咽下腺进行染色，发现咽下腺是由假复层上皮排列的球囊发育成为成年工蜂的复杂器官[11]。通过考马斯亮蓝对不同发育日龄的咽下腺染色，普通光学显微镜下观察染色后的咽下腺，发现9日龄工蜂（哺育蜂阶段）的咽下腺的体积达到最大[6]。扫描电镜观察发现浆蜂咽下腺大小显著高于意蜂，特别是在15日龄[12]。相比于意蜂，浆蜂咽下腺的腺泡体积增大，线粒体、粗面内质网面积变大，核仁数目增多，分泌周期长[9,10,13]。

比较浆蜂和意蜂的形态学，可以发现哺育蜂阶段浆蜂咽下腺分泌活性的增强，这也为进一步丰富工蜂咽下腺的形态学以及掌握咽下腺形态发育与蜂王浆分泌能力提供理论参考。

1.2 咽下腺的生理功能相关研究进展

咽下腺的发育周期与劳动分工密切相关，但并不受日龄的限制，为适应蜂群的需要，咽下腺在大小和形态上也有很大的变化[14,16]。咽下腺在哺育蜂中主要负责分泌蜂王浆，而在采集蜂中主要职责转变为分泌消化分解酶等[17-18]。哺育蜂阶段，咽下腺发育饱满并合成王浆主蛋白（Major Royal Jelly Proteins,MRJPs），而在采集蜂阶段，它们会萎缩并合成将花蜜加工成蜂蜜的碳水化合物代谢酶[19-20]。蛋白质是蜂王浆的主要成分，超过80%的蜂王浆蛋白由MRJPs组成[21]；MRJPs一般是含铁量最多的蛋白，一定量的铁可以提高蜂王浆的营养价值[22]。此外，哺育阶段的哺育行为会刺激咽下腺分泌相关蛋白[16,23]。

随着组学技术的发展，基于日龄依赖性的工蜂咽下腺发育阶段的转录组和蛋白质组的研究大量涌现。转录组学分析不同发育阶段意蜂咽下腺的差异基因，结果显示大量上调差异基因参与核糖体、内质网中的蛋白质加工、蛋白质输出等通路[24]；蛋白质组学分析意蜂咽下腺不同发育阶段的蛋白质，其中包括MRJPs、细胞骨架、抗氧化剂活性、发育调节以及碳水化合物、脂质和蛋白质代谢相关的蛋白质[25]；意蜂和浆蜂蛋白质组学的全面表征和比较发现：浆蜂哺育蜂阶段咽下腺中的大量上调蛋白参与能量代谢、蛋白质生物合成、氨基酸代谢、细胞骨架和抗氧化。这些上调蛋白质参与的生化功能不仅促进咽下腺的发育而且也激发其分泌大量蜂王浆的能力[12,16]。

MRJPs属于Yellow蛋白质家族成员，由一系列的家族基因编码，包括MRJP1～9[26]。具有营养价值功能的MRJP1～3和MRJP5占蜂王浆蛋白总量的82%～90%，其中MRJP1是MRJPs家族成员中含量最丰富的一种，由单体和低聚形式组成，该低聚物的分子量介于350～420 kDa之间，可分为55～5 kDa的单元。MRJP2，MRJP3，MRJP4和MRJP5是 介 于49～80 kDa之间的糖蛋白[27-28]。工蜂咽下腺组织中的MRJP1～5和MRJP7的基因表达量和蛋白质含量呈日龄依赖性，并且在哺育蜂阶段其表达量增加而在采集蜂阶段减少。但MRJP6的表达谱相对其他MRJPs有很大差异，其在采集蜂阶段的咽下腺中表达量高于哺育蜂阶段[29]。另外一些基因，包括Apis mellifera buffy(Ambuffy)、Apis mellifera gustatory receptor 10(Am-GR10)、Major royal jelly protein 2(Mrjp2)在哺育蜂咽下腺中的表达量高于采集蜂，暗示它们在蜜蜂的哺育行为中起着基础性作用[30-31]。此外，哺育蜂咽下腺的生理状态也受到蜕皮激素和幼虫信息素相关信号传导的协同调控[30]。

2 上颚腺

2.1 上颚腺的形态结构

工蜂上颚腺由分泌部和储液囊二部分结构组成，分泌部的分泌细胞中布满储存池，这与工蜂的分泌功能有关[32-34]。研究显示：意蜂工蜂的上颚腺形态从羽化出房到采集过程中呈无规律变化，体积不随日龄增长发生明显的变化，在出房时上颚腺发育已基本完成[35]。

2.2 上颚腺的生理功能以及研究进展

工蜂上颚腺主要合成和分泌脂肪酸（蜂王浆主要成分之一）以及蜂群报警激素相关的2-庚酮等信息素[36]，工蜂上颚腺分泌脂肪酸的主要功能用于幼虫食物营养[37]。上颚腺的组成和分泌量不仅取决于蜜蜂的级型，而且还取决于工蜂的日龄[38]。蜂王浆的成分主要由水、蛋白质、糖类、磷脂类、脂质、矿物质和维生素等组成，其中脂质主要由中链脂肪酸组成。脂质中的主要成分10-羟基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2(E)-decenoic acid,10-HDA）是蜂王浆所特有的成分，也是评价蜂王浆质量的重要参考标准[28]。蜂王浆已被证明具有广泛的药理作用，包括抗氧化活性、抗炎症活性、免疫调节活性等[28]，蜂王浆的抗菌作用也是其重要生理功能之一，与蜂王浆含有的10-HDA有关。此外，对哺育蜂脑、上颚腺、咽下腺转录组测序发现抗菌肽基因在咽下腺中的表达量显著高于脑部和上颚腺组织，暗示蜂王浆的抗菌作用还与蜂王浆中丰富的抗菌多肽有关[39]。同时，文献报道：上颚腺还分泌糖类，其中包括D-葡萄糖、果糖和蔗糖[40]。

工蜂上颚腺主要合成10-HDA、10-羟基癸烯酸（10-hydroxy-decanoic acid，10-HDAA）等ω位功能化脂肪酸，但也合成少量的9-HDA等ω-1位功能化脂肪酸[37,41,42]。哺育蜂上颚腺合成10-HDA和10-HDAA的量一般高于采集蜂[43]，并且蜂王浆成分中的ω-羟基酸（10-HDA、10-HDAA）及其相应的二酸是由哺育蜂上颚腺分泌的[44]，这些酸是蜂王浆中的主要脂质成分[38]。

工蜂上颚腺分泌物合成的生化途径报道较多，一般认为，硬脂酸是上颚腺合成分泌物的最适合前体[45]。硬脂酸经过ω-羟基化得到ω-羟化硬脂酸，ω-羟化硬脂酸经过一系列β-氧化和功能化修饰得到主要分泌物10-HDA[46]。脂肪酸的合成均经过羟基化、β氧化和功能集团修饰。Plettner等[37]认为羟基脂肪酸的β-氧化过程中可能有不同种类的酶催化不同长度的脂肪酸，其中细胞色素P450是负责催化末端羟基化的关键蛋白[47]。此外，细胞色素P450与昆虫体内保幼激素、蜕皮激素的合成密切相关[47]。

工蜂上颚腺分泌物的相关研究多见于借助GC-MS、HPLC技术定量检测工蜂上颚腺内的10-HDA含量，如：GC-MS对黑小蜜蜂（Apis andreniformis Smith）、小 蜜 蜂（Apis florea Fabricius）、大蜜蜂（Apisdorsata Fabricius）、东方蜜蜂（Apis cerana Fabricius）、西方蜜蜂（Apis mellifera L.）5种蜂的工蜂上颚腺内容物进行测定，结果表明：10-HDA在大蜜蜂和西方蜜蜂工蜂上颚腺中含量较高[41]；利用HPLC对0～30日龄意蜂工蜂头部的10-HDA进行测定，结果发现工蜂上颚腺中10-HDA含量随日龄总体呈逐渐上升的趋势，在10～20日龄间保持平衡，30日龄含量达到最高，推测10～20日龄工蜂可能参与哺育行为，上颚腺分泌物有一部分已分泌进入蜂王浆中，而25、30日龄处于采集阶段，因此，10-HDA含量处于较高值[48]。

借助不断发展的组学技术，有关上颚腺参与蜂王浆分泌过程合成主要脂肪酸物质的生化过程在转录组和蛋白质组方面的研究也取得了一定的进展。转录组学分析意大利蜜蜂上颚腺分泌物合成途径，发现细胞色素P450（CYP450）家族基因参与脂肪酸β-氧化和ω-氧化，其中CYP6AS8是工蜂中CYP450家族基因中表达量最高的基因，这一结果有助于阐明脂肪酸衍生的信息素生物合成的分子基础[49]。

李建科团队利用蛋白质组对日龄依赖性的意蜂和浆蜂上颚腺进行比较，结果显示刚出房工蜂中，蛋白质组形成于上颚腺发育的起始阶段。在哺育蜂阶段，它在脂质合成中驱动高分泌活性；在采集蜂阶段，它通过诱导脂质代谢和小分子等活动，合成特殊气味物质以提高采集效率。特别在哺育蜂阶段，特异性和高度丰富的蛋白主要富集于与物质转运和脂质合成相关的通路，这表明上颚腺优先启动脂质合成中的高分泌活性以作为提供幼虫营养方面的来源，正是通过这个过程，哺育蜂上颚腺通过激活脂质合成维持所需的脂肪酸来源（蜂王浆的主要成分）并最大限度地降低脂质降解以增加10-HDA合成，从而有助于提高蜂王浆的产量[38]。

3 脑

3.1 脑的形态结构

蜜蜂的大脑由几丁质外壳包围，打开蜜蜂头部正面几丁质后，整个脑隐藏于咽下腺、头唾腺以及眼部色素下面[50]。大脑体积不足1 mm3，重量不足1 mg，神经元不足1万个，拥有的神经细胞不足100万个，但大脑有着一般模式昆虫所不具备的认知能力[51-53]。

3.2 脑的生理功能以及研究进展

蜜蜂的大脑几乎能够调控它所有的行为，如，学习记忆行为、哺育行为、采集行为、跳舞行为等。蜜蜂表现出的各种行为响应由脑部相对简单的神经系统所调控，其中包括从哺育行为到采集行为的生命过渡过程，如分泌蜂王浆哺育幼虫、采集、识别颜色和嗅觉线索、舞蹈交流、群体防御等[54-56]。

蜂王浆的分泌由哺育蜂哺育行为所介导，这一哺育行为已被人工用于生产蜂王浆供人类食用，由哺育行为介导的蜂王浆分泌过程离不开哺育蜂脑部复杂网络机制的调控。一般认为，蜂王浆由适龄工蜂的咽下腺、上颚腺共同分泌[57-58]，而哺育行为介导的王浆分泌过程离不开中心器官——大脑的调控。脑部中枢神经系统通过调控咽下腺和上颚腺相关基因的表达，促进这些腺体的发育并且增强它们分泌蜂王浆的功能[59]。

基于日龄依赖性工蜂在从巢内工作向巢外采集的转变过程[60-62]与大脑的结构、基因表达和蛋白质合成的变化相关[63]，同时也与激素和神经化学物质的生理过程以及成千上万基因的表达变化相关[31]，例如其在功能和形态方面的转变会受保幼激素的控制[64]。

现大多研究主要集中从组学技术方面探讨脑部调控行为的分子机制。转录组学方面分析脑部相关基因的表达变化，发现哺育蜂的大脑中高量表达的基因可能参与轴突形成和细胞黏附，这些基因可能参与哺育蜂在转向采集活动之前的大脑结构变化[60]。哺育蜂脑部磷脂酰肌醇信号转导和花生四烯酸代谢水平的提高有助于增强嗅觉对幼虫信息素刺激的反应[65]，而在采集蜂脑部，与神经信号传导相关的通路（SNARE在囊泡运输中的互作，wnt信号通路，TGF-beta信号通路等）的功能加强，增强了采集蜂的采集能力，这可以为蜂群提供充足的蛋白质食物进而满足哺育蜂分泌蜂王浆对蛋白质的需求[65]。从蛋白质组学方面分析脑部膜蛋白，发现哺育蜂的大脑对蜂王浆分泌产生了一种独特的神经肽，哺育蜂分泌蜂王浆能力的增强与调节行为过程中高度增强的神经肽有关，并通过调节水稳态、对幼虫信息素的识别、采集能力和收集花粉来增加蜂群群体的营养供应进而提高蜂王浆的分泌，从而在提高蜂王浆产量方面发挥了作用[59]。

此外，除脑部神经肽方面的相关研究外，关于脑部调控王浆分泌机制的研究多见于基于日龄依赖性开展的工蜂脑部磷酸化蛋白质组学和膜蛋白质组学方面，以及基于日龄依赖性开展意蜂与浆蜂之间的脑部蛋白质组学工作[55,58,59,63]。此外，借助微阵列分析技术而展开基于日龄依赖性的工蜂脑部基因表达变化也有相关的报道[66]。

4 小结与展望

蜂王浆分泌机制的研究机理一直是蜂业界探讨的热点和难点。到目前为止，对蜂王浆分泌的分子机制的广泛研究集中在咽下腺组织，如李建科团队通过对意蜂咽下腺蛋白质组学和代谢组学的深入研究发现并明确了调控蜂王浆高产的关键代谢通路和蛋白质功能[16,58,67]。然而，蛋白质合成和蜂王浆分泌在哺育阶段的机制尚不清楚。

目前在对上颚腺分泌物中相关脂肪酸的研究取得了一定的进展，但对上颚腺分泌物中其他方面的分子机理的研究并不多。研究蜜蜂上颚腺中基因以及蛋白的表达与调控，对揭示上颚腺分泌物合成的分子机制和深入了解上颚腺相关靶基因诱导蜂王浆分泌的分子机制有着重要的意义，结合对脂肪酸代谢过程的了解，能够为旨在提高浆蜂中10-HDA含量的蜜蜂分子育种工作提供参考。

蜜蜂大脑是进行信息处理和行为调控的中央枢纽，对协调咽下腺和上颚腺等组织分泌蜂王浆有着重要的作用，但目前科研界对蜜蜂大脑的研究主要集中在劳动分工、学习记忆、级型分化等方面，其中在劳动分工方面的研究会涉及哺育蜂哺育行为相关的网络调控机制，这也能够为人们深入脑部调控腺体组织分泌蜂王浆的分子机制提供参考。

综上所述，本文总结了与蜂王浆分泌密切相关的3个腺体/器官的研究进展，期望从多维度为后续蜂王浆分泌的分子机制提供新的视角和理论参考。然而，目前关于蜂王浆分泌机制的研究主要集中于自然蜂群中不同日龄工蜂的咽下腺、上颚腺和脑，筛选了大量与蜂王浆分泌机制相关的关键候选基因。但是这些关键候选基因中部分基因也有可能是由于日龄差异所导致，因此，在后续研究中应该利用蜜蜂行为的可塑性，人工组建相同日龄的蜂群，排除日龄因素的影响，进而缩小与蜂王浆分泌机制相关的候选基因的范围。同时随着基因组编辑CRISPR/Cas9技术的成熟以及在蜜蜂中成功的应用，该技术将为后期关键候选基因功能的验证提供了有力的工具，同时也为阐明蜂王浆分泌和调控的分子机制提供新的方向。