丁米娜 邓春玲 李月 朴英实 陈丽艳,

(延边大学 1医学院生物化学与分子生物学，吉林 延吉 133002；2肿瘤研究中心)

胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，其具有发病隐匿、进展迅速、易转移等特点〔1〕。据国家癌症中心统计，2014年中国胰腺癌发病例数9.22万，位居恶性肿瘤发病第10位，死亡例数8.11万，居于癌症死亡第6位，严重威胁我国居民生命健康安全〔2〕。目前，胰腺癌的治疗方法主要包括手术治疗、放化疗、生物治疗与靶向治疗〔3〕。分子靶向治疗具有特异性强，灵敏度高，副作用轻等优点，是胰腺癌治疗的潜在有效治疗方法。因此，寻找新型肿瘤分子标志物对胰腺癌早期诊断及靶向基因治疗具有重要意义。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子(Tiam)1最初是在小鼠T淋巴瘤细胞高侵袭变异株中分离鉴定得到〔4〕。有研究表明，Tiam1在肿瘤细胞的侵袭、迁移和肿瘤发生发展中发挥着重要作用〔5〕。本课题组前期研究发现，Tiam1在胰腺癌组织中高表达，沉默Tiam1基因能体外抑制胰腺癌细胞的增殖、转移与侵袭〔6〕。本文旨在通过建立胰腺癌小鼠移植瘤模型，在体内进一步研究Tiam1基因沉默对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的影响，并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 改良Eagle培养基(DMEM)培养液购自美国BI公司；胰蛋白酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；Lipofectamine 3000 购自Invitrogen公司。siRNA转染试剂购于广州锐博生物技术有限公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自美国 Millipore 公司。免疫印迹化学发光试剂(ECL Reagent)购自江苏碧云天生物技术研究所。免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；β-actin 抗体、E-钙黏蛋白(cadherin)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体(美国Proteintech公司)，Tiam1抗体、Ki-67抗体、Slug抗体(美国Santa Cruz 公司)。裸鼠10只购自北京维通利华实验动物技术有限公司，鼠龄为4～6 w，体质量18～22 g；人胰腺癌BxPC-3细胞由延边大学肿瘤研究中心提供。

1.2Tiam1-siRNA转染胰腺癌BxPC细胞 取对数生长期细胞消化、离心，接种于6孔板中。待细胞长至50%～60%融合状态时进行转染处理，按照试剂盒说明书操作。分为未转染(con)组、阴性对照(si-con)组和si-Tiam1组，转染48 h后，提取各组细胞蛋白，Western印迹检测Tiam1沉默效果。

1.3Western印迹实验 细胞转染处理后，提取蛋白定量，变性，用于蛋白表达水平检测。将样品加入6%～8%的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯凝胶电泳分离。在冰盒中转膜65～75 min。5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗(Tiam1和β-Actin比例均为1∶1 000)4℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗(1∶3 000)常温孵育1 h，TBST洗膜，加ECL发光液后，曝光。

1.4移植瘤小鼠模型建立 对BxPC细胞进行转染处理后，体外常规培养，取对数生长期的细胞胰酶消化，离心，计数。用DMEM与Matrigel胶按照1∶1的比例重悬细胞，制备成浓度为5×107/ml的单细胞悬液。量取制备好的单细胞悬液5×106/100 μl在无菌条件下接种于裸鼠右侧腋窝皮下，建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型。

1.5肿瘤生长曲线的绘制及瘤体质量的测定 每天观察肿瘤生长情况，待肿瘤形成后，每2 d用游标卡尺测量小鼠肿瘤的最长径(a)和横径(b)，计算肿瘤体积V=a×b2/2， 绘制肿瘤生长曲线；采用颈椎脱臼法处死裸鼠，完整剥离肿瘤组织，对瘤体称重并拍照观察，将瘤体在多聚甲醛中固定后，石蜡包埋、切片，并进行常规苏木素-伊红(HE)染色。

1.6免疫组织化学染色法 免疫组化染色试剂盒为中杉金桥 PV-9000 通用型二步法检测试剂盒。取两组石蜡组织3 μmol/L切片，常规脱蜡及水化，抗原修复，加一抗4℃孵育过夜；次日二抗，DAB显色，然后HE复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明，最后中性树胶封片。每张切片在200倍显微镜下观察拍照。

1.7统计方法 采用Prism6.01软件进行方差分析。

2 结 果

2.1胰腺癌裸鼠移植瘤模型的建立 采用RNA干扰技术转染处理胰腺癌BxPC-3细胞，Western印迹实验检测Taim1沉默效果，结果如图1所示，与si-con组(0.577±0.076)比较，si-Tiam1组Tiam1蛋白的表达水平明显降低(0.331±0.043,P<0.05)。将转染处理后的胰腺癌BxPC-3细胞皮下接种于裸鼠体内，两组裸鼠在接种7 d后，均出现肉眼可见的肿瘤，成瘤率100%，且裸鼠生存状态未受到明显影响，表明成功建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型。

图1 Western印迹实验检测Tiam1基因的沉默效果

2.2沉默Tiam1对小鼠移植瘤生长及瘤体质量的影响 在细胞接种第10天开始，每2 d测量两组移植瘤体积并绘制生长曲线，结果如图2示，与对照组相比，si-Tiam1组的移植瘤生长明显被抑制(P<0.05)，细胞接种32 d时，处死裸鼠，剥离移植瘤，并测量肿瘤体积和瘤体质量。与si-con组移植瘤体积(2.21±0.51)cm3相比，si-Tiam1组移植瘤体积(1.28±0.37)cm3明显降低(P<0.05)；si-con组、si-Tiam1组瘤体质量分别为(1.98±0.58)g和(1.32±0.21)g，差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明沉默Tiam1基因能显著抑制胰腺癌移植瘤生长。

与si-con组比较：1)P<0.05图2 两组胰腺癌裸鼠皮下移植瘤成瘤生长曲线(A)与瘤体标本(B)

2.3沉默Tiam1对小鼠移植瘤组织形态结构及Ki-67的蛋白表达影响 肿瘤组织切片经HE染色后显微镜观察，结果显示，与对照组相比，si-Tiam1组的小鼠移植瘤组织中细胞出现皱缩，密度降低，片状坏死等病理学性改变(图3)；免疫组化检测增殖相关蛋白Ki-67的表达，结果显示，Ki-67蛋白主要定位于细胞核， si-Tiam1组的移植瘤组织中Ki-67的表达比对照组明显降低(图4)，表明沉默Tiam1能抑制移植瘤组织中Ki-67的表达。

图3 HE染色检测沉默Tiam1对胰腺癌裸鼠移植瘤组织形态结构的影响(×200)

图4 IHC染色检测沉默Tiam1对胰腺癌裸鼠移植瘤组织Ki-67蛋白的影响(×200)

2.4沉默Tiam1对小鼠移植瘤组织(EMT)相关蛋白表达的影响 IHC染色检测EMT相关蛋白的表达，结果如图5所示，E-cadherin和Slug蛋白表达的阳性部位主要定位于细胞核，而Vimentin主要定位于细胞质。在对照组移植瘤组织中Vimentin、Slug明显可见有棕褐色着色，但si-Tiam1组移植瘤组织中棕褐色表达减弱，而E-cadherin蛋白在两组中的表达相反，表明沉默Tiam1能下调Vimentin、Slug蛋白的表达，上调E-cadherin蛋白的表达，提示沉默Tiam1能够抑制裸鼠移植瘤组织的EMT进程。

图5 IHC染色检测沉默Tiam1对胰腺癌裸鼠移植瘤组织EMT相关蛋白的影响(×200)

3 讨 论

Tiam1是鸟苷酸转换因子(GEF)家族成员之一，主要通过催化GTP/GDP转换并激活Rho家族重要成员Rac1的活性，从而影响肿瘤细胞的迁移、侵袭等活动〔7〕。吕铮等研究表明，Tiam1高表达与结直肠腺患者的预后密切相关〔8〕。杨洋等〔9〕研究显示，Tiam1蛋白在卵巢癌组织中高表达，且与卵巢癌的转移密切相关。Shi等〔10〕研究也证实，在胃癌细胞中，沉默Tiam1能够通过调节细胞骨架重建抑制细胞的迁移与侵袭。本课题组前期研究〔6〕利用体外细胞实验证实沉默Tiam1可显著抑制胰腺癌细胞增殖、转移与侵袭。因此，本论文将siRNA转染后的BxPC-3细胞接种于裸鼠皮下构建胰腺癌移植瘤模型，结果显示，沉默Tiam1能显著抑制移植瘤的瘤体体积和质量。Ki-67作为核抗原与肿瘤细胞生长、增殖密切相关，已被广泛应用于肿瘤细胞的增殖活性鉴定。本研究结果表明，沉默Tiam1可明显抑制移植瘤组织中Ki-67的蛋白表达。

EMT进程使肿瘤细胞表型发生改变，从而获得高侵袭能力，这在多种恶性肿瘤的发生、发展和转移过程中起着至关重要的作用〔11〕。EMT进程通常伴随细胞上皮标志物E-cadherin的减少，细胞间质标志物如Vimentin、N-cadherin及转录因子Snail、Slug等的增加〔12〕。目前，已有研究报道Tiam1在肺腺癌细胞中阳性表达，其影响肿瘤发展的机制可能与E-cadherin表达的下降及Vimentin的表达增强有关〔13〕。Liu等〔14〕研究表明，Tiam1的异常表达能够通过Wnt/β-catenin信号通路调控EMT进程，进而促进甲状腺癌的转移。本课题前期研究结果证实，沉默Tiam1能够调控胰腺癌细胞的EMT进程。因此，本论文进一步通过免疫组织化学染色检测沉默Tiam1对裸鼠移植瘤组织EMT相关蛋白表达的影响。结果提示沉默Tiam1抑制胰腺癌移植瘤组织的EMT进程。

综上，沉默Tiam1对胰腺癌裸鼠移植瘤的生长具有抑制作用，其影响肿瘤发生发展的机制可能与Ki-67、Vimentin、Slug表达的降低及E-cadherin表达的升高有关。本研究提示Tiam1在小鼠胰腺癌的发生发展中具有重要作用，为胰腺癌的分子靶向治疗提供新的理论依据。