李淑静 顾国建 盛维新 卑占宇

(1承德护理职业学院药学系，河北 承德 067000；苏州大学附属太仓医院 2病理科；3泌尿外科)

肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,病理上70%～80%为肾透明细胞癌〔1〕。其对放化、疗不敏感，手术是首选治疗方案〔2〕。但因为其起病隐匿,症状不明显,诊断时多达三分之一的肾透明细胞癌患者已经侵袭其他邻近组织或转移到远处,约一半的病人会术后复发,预后较差,严重威胁患者生命健康〔3〕。目前研究发现多种基因表达异常与肿瘤侵袭、转移密切相关,其中星形细胞上调基因(AEG)-1及基质金属蛋白酶(MMP)9与其关系密切。本文采用Western印迹法及免疫组化方法检测肾癌及癌旁组织中AEG-1及MMP9蛋白的表达,并探讨其临床意义及相互联系。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集苏州大学附属太仓医院泌尿外科2017年1～12月手术切除的肾癌及距癌灶3 cm以上的癌旁新鲜组织各15例。每例取一部分组织放置在液氮中，另一部分组织制成石蜡标本保存。另从病理科收集2013年1月至2016年12月手术切除的66例肾癌石蜡标本。所选患者手术前未接受放疗、免疫或化疗。共81例石蜡标本，病理类型全部为肾透明细胞癌，其中男52例,女29例,年龄23～75岁,平均58.7岁。根据2010年美国联合癌症委员会(AJCC)肾癌临床分期:Ⅰ期25例,Ⅱ期29例,Ⅲ期20例,Ⅳ期7例,病理上采用Fuhrman 分级:其中G1期35例,G2期22例,G3期24例。门诊或电话随访3～60个月。

1.2试验方法

1.2.1Western印迹检测肾癌及癌旁组织中AEG-1及MMP9的表达 取出保存于液氮中的肾癌与癌旁组织标本，切取 100 mg组织放入研钵，置于冰上，迅速研磨成粉；添加含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解细胞(碧云天公司),离心，提取蛋白，沸水加热3～5 min，使蛋白充分变性，10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙酰胺凝胶电泳(PAGE),然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，3%牛血清白蛋白(BSA)阻断后1 h,膜与一抗(AEG-1或MMP9 或β-actin 1∶1 000)4℃过夜,洗膜,添加二抗(1∶8 000),摇床摇动1 h,随后TBST洗膜,加发光液,曝光成像,β-actin 作为蛋白质负荷计量。

1.2.2链霉卵白素-过氧化物酶(S-P)免疫组化染色法 实验中所用一抗兔抗人AEG-1单克隆抗体(1∶150)从 Zymed Laboratories公司购买,兔抗人MMP9单克隆抗体(1∶100)、SP免疫组化试剂盒购于福州迈新生物公司。将标本连续4 μm切片，再脱蜡、水化后,每个标本行苏木素-伊红(HE)和SP免疫组化染色,操作过程参见相关文献〔4,5〕。AEG-1和MMP9以肿瘤细胞质着色为阳性细胞,由两位病理科医师结合染色细胞所占百分比和染色强度做出判断。按阳性细胞所占肿瘤细胞的百分比评分:0分(无染色细胞),1分(<10%),2分(10%～50%),3分(>50%),再按显色程度计分:0分(无染色细胞),1分(细胞被染浅黄色),2分(棕黄色),3分(棕褐色)，两者相加≥3分为阳性,0～2分为阴性〔5〕。

1.3统计学方法 采用SAS9.0软件进行t检验、χ2检验。应用Kaplan-Meier生存曲线和Log-Rank 检验进行生存分析。

2 结 果

2.1AEG-1和MMP9在肾癌及癌旁肾组织中的表达 Western印迹检测结果提示，AEG-1 在15 例肾癌组织、癌旁肾组织中的相对值分别为(0.606±0.079)、(0.112±0.041)，肾癌组织中AEG-1蛋白 表达明显高于癌旁肾组织(P<0.001)；MMP9 在肾癌组织中的表达(0.622±0.085)也显著高于癌旁肾组织(0.179±0.078，P<0.001)，见图1。免疫组织化学法结果显示，AEG-1和MMP9阳性物质位于细胞质,阳性细胞为细胞质被染成棕黄色，其中，癌组织AEG-1阳性49例(60.5%)、阴性32例(39.5%)，MMP9阳性51例(63.0%)，阳性30例(37.0%)；癌旁组织AEG-1阳性2例(13.3%)，阴性13例(86.7%)，MMP9阳性3例(20.0%)，阳性12例(80.0%)。两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图1 AEG-1和MMP9在肾癌及癌旁组织中的表达

图2 AEG-1和MMP9在肾癌组织中的染色结果(DAB,×200)

2.2AEG-1及MMP9与肾癌病理、临床特征的关系 AEG-1及MMP9蛋白表达增高与肾癌的病理分级、淋巴结转移、临床分期密切相关(P<0.05);而与患者性别、年龄、肿瘤大小无显著相关性(P>0.05)，见表1。

表1 AEG-1及MMP9表达的影响因素〔n(%)〕

2.3肾癌组织中AEG-1与MMP9的相关性分析 肾癌组织中，AEG-1与MMP9同阳性41例，同阴性22例，AEG-1阳性、MMP9阴性8例，AEG-1阴性、MMP9阳性10例，AEG-1与MMP9蛋白表达呈正相关(r=0.531,P<0.001)。

2.4AEG-1和MMP9 与肾癌生存的相关分析 在肾癌组织中，AEG-1蛋白高表达的患者与低表达的患者相比，总生存较差(P=0.005),MMP9蛋白高表达的患者与低表达的患者相比，总生存较差(P=0.018),见图3。

图3 基于AEG-1和MMP9表达的肾癌患者Kaplan-Meier生存曲线

3 讨 论

2002年,Su等〔6〕发现在人胚胎初级星形细胞被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后,有15个基因表达增高,称为星形细胞上调基因(AEGs),其家族成员的中的AEG-1位于人染色体8q22。多项研究发现,AEG-1在膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、视网膜母细胞瘤等恶性肿瘤组织高表达,它可以抑制细胞的凋亡,促进肿瘤血管生成、细胞增殖、侵袭、转移等〔5,7～9〕。

本研究中,Western印迹及免疫组织化学结果提示：AEG-1蛋白在肾癌细胞中的阳性率明显高于癌旁肾组织。其中，发生淋巴结转移的患者,AEG-1表达相对增高,AEG-1蛋白其表达水平随病理分级增加而增加,并随着临床分期增加而增加,提示AEG-1与肾癌发生、发展中起一定的作用,可用于肾癌的辅助诊断。本文随访结果提示,与AEG-1蛋白阴性患者相比，阳性患者生存时间短,预后不良。这与其他组织肿瘤的预后相似〔10〕。综上，AEG-1蛋白是很好的判断患者预后的指标。随着分子生物学技术的发展,Chang等〔9〕和Zhang等〔11〕等学者将肿瘤细胞中AEG-1进行基因沉默,结果发现肿瘤细胞增殖、迁徙和侵袭能力明显下降,这些研究表明AEG-1是潜在的肿瘤基因治疗的靶点。

MMP家族可以通过降解细胞外基质,进而促进肿瘤细胞侵袭、转移〔12,13〕。MMP9在多种肿瘤组织中高表达,而且与MMP9阴性患者相比，MMP9阳性患者预后不良〔14〕。Western印迹及免疫组织化学结果提示： MMP9蛋白在肾癌细胞中的阳性率明显高于癌旁组织,发生淋巴结转移的患者,MMP9表达相对增高,其表达水平随病理分级增加而增加,并随着临床分期增加而增加,提示MMP9在肾癌发生、发展中起一定的作用。Log-Rank检验显示与阴性患者相比，阳性患者预后不良,这与在其他肿瘤组织中的研究相符合〔15〕,提示其可考虑用于肾癌的辅助诊断,及判断患者预后。

本研究发现,肾癌组织中AEG-1蛋白升高,而MMP9表达也相应升高,二者正相关。有学者研究发现,AEG-1可通过MMP9途径促进肿瘤细胞侵袭和迁移〔15〕。本研究显示,AEG-1基因可能通过MMP9途径促进肿瘤细胞迁移和转移。

综上所述,在肾癌发生发展中,AEG-1及MMP9可能起一定作用,联合检测AEG-1及MMP9有助于肾癌的辅助诊断和判断患者的预后,对其进一步研究,有望成为肾癌基因治疗的新靶点。