周思敏， 郭丽萍， 张 君， 周 璐， 王邦茂

天津医科大学总医院 消化科， 天津 300052

肝脏巨噬细胞在维持免疫稳态中具有重要作用，巨噬细胞的程序性坏死过程与其免疫功能密切相关。受体相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)家族为程序性坏死通路中的关键蛋白。其中，RIP1的泛素化状态是决定传递巨噬细胞存活或死亡信号的关键[1]，RIP3为决定巨噬细胞走向程序性坏死或凋亡的转换器，是介导细胞发生程序性坏死的关键分子[2]。抑制程序性坏死对免疫性肝损伤有保护作用[3]，程序性坏死信号通路或为免疫性肝损伤的潜在治疗靶点。

1 巨噬细胞在肝脏免疫稳态中的作用

巨噬细胞在肝脏免疫稳态中的重要作用已得到越来越广泛的关注。Kupffer细胞是定居在肝脏的巨噬细胞，排列于肝血窦上皮之间构成巨噬细胞屏障，在免疫耐受的形成和维持中具有重要作用[4]。定居在肝脏的Kupffer细胞表面表达多个Toll 样受体(toll-like receptor，TLR)，在调控Kupffer细胞相关细胞因子的比例中具有重要作用[5]。当这些细胞因子比例失调时，自身反应性T、B淋巴细胞活化，在自身免疫性肝炎(AIH)发病中发挥重要作用[6]。AIH是由于机体对自身肝细胞产生免疫反应，进而介导的慢性进行性肝脏炎性疾病。AIH患者单核-巨噬细胞系统处于过度活化状态[7]，肝组织可见大量的巨噬细胞浸润[8]，巨噬细胞持续浸润与肝脏慢性炎症的发生甚至纤维化的发生有十分密切的关系[9]。Zhang等[10]研究指出AIH患者肝组织大量浸润的巨噬细胞高表达RIP3，RIP3信号通路可以调控多种细胞因子的产生进而介导炎性反应，尤其对IL-6的调控作用最为显著，进一步支持了巨噬细胞程序性坏死在AIH致病过程中的重要作用。

在刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)诱导的免疫性肝损伤中，腹腔巨噬细胞活性减弱为导致炎症反应持续存在的重要原因[11]，选择性抑制程序性坏死可显著缓解ConA造成的肝损伤，其作用与巨噬细胞产生的IL-1β等细胞因子减少有关[12]。固有免疫是导致自身免疫性肝损伤发病的重要因素，单核-巨噬细胞功能在固有免疫中的作用已经成为研究热点。AIH小鼠腹腔巨噬细胞表面抗原递呈分子及其协同刺激分子表达减低，小鼠腹腔巨噬细胞抗原递呈功能减低，可能是发病中的重要一环[11]。

2 程序性坏死参与巨噬细胞免疫功能的调节

巨噬细胞在肝脏免疫稳态的维持中具有重要作用，而程序性坏死通路为调控巨噬细胞功能和死亡的关键通路。当外界抗原如脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激巨噬细胞表面的TLR3或者TLR4时，可引起TIR结构域转接蛋白(TIR domain containing adapter inducing interferon-β，TRIF)的募集，TRIF随即与RIP1及RIP3通过RIP同型结构域(RIP homotypic interaction motif, RHIM)相互作用。在Caspase相关分子被抑制的情况下，TRIF/RIP3可以导致下游活性氧(ROS)的异常积累，引起不依赖NF-κB活性的程序性坏死[13]。LPS刺激巨噬细胞后IL-33的释放明显增加，应用Nec-1后则可明显抑制IL-33的释放[14]，提示了LPS刺激巨噬细胞后细胞因子的分泌过程由程序性坏死介导[15]。巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)表达缺失的小鼠表现为巨噬细胞的氧化应激增强，且发生程序性坏死的巨噬细胞增多[16]，提示MIF可能在调控程序性坏死过程中发挥重要作用。Yang等[17]对脑皮质缺血的研究指出，通过对髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，Myd88)信号通路的调控，RIP3的剔除可以使巨噬细胞由M1型向M2型转化。RIP3可与单核-巨噬细胞能量代谢通路中的多种酶作用并增加其活性，促进线粒体产生过多ROS，导致线粒体膜通透性改变，进而使细胞谷氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖代谢增强[18]。

混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL)是程序性坏死的执行者，是存在激酶结构域但缺乏激酶活性的假激酶，是目前发现的程序性坏死最重要的下游效应器。激活的RIP3可磷酸化MLKL的Thr357和Ser358位点，促进程序性坏死的发生，而这两个位点的突变能阻止MLKL与RIP3的结合，进而阻断程序性坏死进程[19]。磷酸化的MLKL由单体状态向寡聚体状态转化，从而结合磷酸肌醇和心肌磷脂，使整个复合体从胞质转移到胞膜或细胞器膜上，并形成通透性孔道，最终细胞膜发生破裂[20]。MLKL还可以促进线粒体分裂因子磷酸甘油酸变位酶5(phosphoglycerate mutase family member 5，PGAM5)募集到坏死复合体上，进而募集线粒体分裂因子1(dynamin-related protein 1，Drp1)。PGAM5通过促进Drp1的673位点丝氨酸去磷酸化激活Drp1的GTPase活性，最终导致线粒体碎片化[21]。坏死细胞释放的内容物DNA片段、ATP、促炎因子等损伤相关模式分子(damage associate molecular pattern molecule，DAMP)会被模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别，从而激活周围细胞的免疫应答，清除死亡细胞[22]。程序性坏死发生后，大量细胞内容物溢出，是导致炎症发生的重要原因，而RIP3或者MLKL的缺失能阻止细胞的死亡和炎症反应的发生[23]。DAMP还可以协同触发生长因子，以持续性地放大炎症效应[24]。RIP3敲除的小鼠，细胞质中的DAMP明显降低，均表明程序性坏死有促炎作用[24]。Ni等[25]指出，ConA诱导的细胞死亡主要为程序性坏死，而不是细胞凋亡，因此程序性坏死在免疫性肝损伤中扮演了重要作用。

3 IKK复合物调控程序性坏死和凋亡通路的转换

3.1 细胞死亡通路的启动 复合体Ⅰ的形成：程序性坏死通常在凋亡被抑制的情况下发生，当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时，程序性坏死作为凋亡的替补形式被激活[26]。能诱导程序性坏死和凋亡的因素非常多，目前研究最广泛的模式是由TNFR1介导的细胞死亡(图1)。TNFα与细胞膜上的性泛素链组合体复合物；IκBα-SR，不可降解的IκBα；Act.D，转录抑制剂放线菌素D；CHX，翻译抑制剂环己酰亚胺。

注：A，当抑制去泛素化酶CYLD活性时，cIAP1/2及LUBAC可以将Ub链偶联到RIP1上，促进RIP1的泛素化进而调控IKK复合物的活化，激活NF-κB通路促进细胞生存。IKK复合物可以直接磷酸化RIP1，进而抑制RIP1的活性及RIP1介导的程序性坏死及凋亡。此外，Fas凋亡抑制分子3也可以调控RIP1的泛素化；B，当在IKK复合物下游抑制NF-κB通路的活性时(IκBα-SR、Act.D、CHX等)，RIPK1泛素化完成，有活性的IKK复合物仍然抑制RIP1的活性，复合体Ⅱ a活化，此过程为不依赖于RIP1的凋亡过程；C，cIAP1/2及LUBAC缺失既可以导致依赖RIP1激酶活性的凋亡，又可以诱导依赖RIP1激酶活性的程序性坏死。当在IKK复合物上游抑制NF-κB通路的活性时(如cIAP1/2及LUBAC缺失时)，RIP1泛素化被抑制，IKK复合物活性被抑制，IKK复合物对RIP1的抑制被解除。活化的RIP1促进复合体Ⅱ b的形成，此即为依赖RIP1的凋亡过程；如果Caspase-8被抑制或者RIP3、MLKL表达被上调，则形成坏死复合物，细胞通过依赖RIP1的程序性坏死过程死亡。CYLD，头帕肿瘤综合征蛋白；cIAP，细胞凋亡抑制蛋白；LUBAC，线

图1TNF-R1介导的程序性坏死与凋亡的交互调控

TNFR1受体结合后，受体迅速发生构象变化，并通过质膜内侧的死亡结构域募集多种蛋白参与这一级联反应过程，包括：RIP1、TNFR1相关死亡结构域(TNFR1-associated death domain，TRADD)、TNF受体相关因子2(TNFR -associated factor 2，TRAF2)、LUBAC及cIAP等，它们一起形成“复合体Ⅰ”[27]，RIP1的泛素化状态是决定传递巨噬细胞存活或死亡信号的关键[1]。cIAP1/2是重要的泛素化E3酶，可以产生K63连接的泛素链，这是RIP1的聚泛素化过程所必需的。此外，由cIAP产生的K63泛素链可募集到LUBAC，该复合物可产生M1连接的泛素链。

3.2 去泛素化酶及NF-κB通路对细胞存活及死亡的调节 目前为止，CYLD是最为明确的调节RIP1去泛素化的酶，可通过特异性去除RIP1上的K63多聚泛素链抑制NF-κB通路的活性进而使细胞走向死亡[28]，而RIP1的K63聚泛素化修饰可起到激活NF-κB信号通路进而促存活的作用。CYLD的一个重要的特点是具有与TRAF2及NF-κB必需调节分子(NF-κB essential modulator，NEMO)结合的特异性位点[29-30]。CYLD对于TLR介导的程序性坏死是必要的，转录水平下调CYLD可以使巨噬细胞不发生程序性坏死[31]。Legarda等[32]指出，当巨噬细胞中TLR4活化时，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8(cysteinyl aspartate specific proteinase 8，Caspase-8)可以在D215 位剪切 CYLD，进而抑制程序性坏死的发生。采用质粒构建的方法，CYLD在D215位点突变或者使用Caspase 抑制剂zVAD-FMK(benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone)时，CYLD不能被Caspase-8剪切，导致RIP1发生去泛素化并与RIP3 结合，促进巨噬细胞程序性坏死的发生。Caspase-8可以切割 RIP1、RIP3及CYLD 来抑制程序性坏死[33]，其抑制剂zVAD对于RIP1/RIP3复合体的形成是必要的[34]。CYLD还可以调节坏死复合体中RIP1的去泛素化从而促进坏死复合体的活化，促进程序性坏死的发生，此外，CYLD还可以调控程序性坏死中ROS的产生[35]。

3.3 IKK复合物调控程序性坏死和凋亡通路的转换 IKK复合物是否受到抑制是决定细胞通过程序性坏死通路死亡或者通过凋亡通路死亡的关键因素。IKK亚基二聚化可以导致其激酶区域的磷酸化，若此过程伴随IKK亚基C末端的非磷酸化，则IKK处于高活性状态从而发挥作用[28]。此外，IKK复合物的活性还取决于RIP1的泛素化状态[1]，cIAP1/2及LUBAC可以将Ub链偶联到RIP1上进而促进RIP1的泛素化，进而募集NEMO及 TAK结合蛋白2/3(TAK1-binding protein 2/3，TAB2/3)。一方面，NEMO起到稳固IKK复合体与泛素化链的作用，它的缺失可以导致IKK在此通路的作用消失，从而诱导程序性坏死。另一方面，TAB2/3可以激活转化生长因子激酶1(transforming growth factor activated kinase-1，TAK1)，进而磷酸化并激活IKKβ，促进细胞存活[36]。

当从IKK复合物的上游或者下游抑制此通路时，细胞将通过不同的方式死亡。当在IKK复合物下游抑制NF-κB通路的活性时，如应用IκBα-SR、Act. D 或者CHX，此时RIPK1泛素化完成，有活性的IKK复合物不能使得蛋白酶体IκBα降解，但可以通过磷酸化RIP1进而抑制RIP1的活性及RIP1介导的程序性坏死及凋亡[37]，复合体Ⅰ变得不稳定，导致RIP1从细胞膜上解离，形成由TRADD、Fas相关死亡域蛋白(Fas-associated with death domain protein，FADD)、Caspase-8组成的复合体Ⅱa。细胞通过不依赖RIP1的凋亡途径死亡[38]；当在IKK复合物上游抑制NF-κB通路的活性时(如cIAP1/2及LUBAC缺失时)，Ub链不能偶联到RIP1上，RIP1的泛素化则被抑制，IKK复合物的活性亦被抑制，IKK复合物对RIP1磷酸化的作用被抑制，细胞通过依赖RIP1的凋亡或程序性坏死途径死亡[39]。活化的RIP1可以促进由RIP1、RIP3、FADD、Caspase-8组成的复合体Ⅱb的形成，此即为依赖RIP1的凋亡过程；当RIP3和MLKL的表达水平足够高或Caspase-8活性降低甚至缺失时，复合体Ⅱb则促进坏死复合体的形成，激活依赖RIP1的程序性坏死通路[37]。

此外，RIP3在细胞凋亡中也起一定的作用。RIP3激酶位点点突变后，可以通过激活Caspase-8引起致死性的细胞凋亡；而剔除RIP3则不会激活Caspase-8，小鼠可以存活下来[40-41]。同样地，MLKL的剔除可以引起RIP3的异常积累，导致Caspase-8的激活，进而引起致死性的细胞死亡，但在RIP3被剔除后上述情况则不会发生[42]。Newton等[40]在RIP3的161位点用天冬酰胺替换天冬氨酸，从而构建了丧失RIP3酶活性的遗传工程小鼠(RIP3-D161N)。RIP3被完全剔除的小鼠能存活，而RIP3-D161N小鼠可以诱发依赖Caspase-8的致命性细胞凋亡，进而引起小鼠卵黄囊血管异常。

4 程序性坏死与肝Kupffer细胞对肝外抗原的免疫应答

Kupffer细胞在肝外抗原诱发的免疫性肝脏损伤中发挥重要的调控作用。Kupffer细胞表面可以表达PRR，使其能够对包括LPS在内的肠源性细菌产物作出应答[43]。肠道菌群失调及肝脏PRR缺陷可导致肝脏共生菌群的紊乱，进而引发肝脏免疫系统的异常激活。降低肝脏Kupffer细胞PRR信号的阈值，使其对肠源性细菌代谢产物敏感性增加，可以引发肝脏炎症[44]。

无菌小鼠能抵抗ConA诱导的肝损伤[45]，提示了肠道菌群在启动免疫介导的肝脏炎症中的重要作用。Manfredo等[46]研究发现，AIH患者肠屏障功能异常，且肝组织中可测得肠道鹑鸡肠球菌的 DNA，提示特定的肠源性细菌在肠肝免疫对话中发挥关键作用。Blériot等[47]指出肠道单核细胞增多性李斯特菌和肠道沙门氏菌的感染可以导致肝脏Kupffer细胞的程序性坏死，随后单核细胞起源的巨噬细胞募集到肝脏从而取代坏死的Kupffer细胞。Pamer等[48]也指出李斯特菌对肝脏固有免疫和适应性免疫都有很强的调节作用。通过调控DAMP激活的PRR信号通路，程序性坏死在LPS介导的免疫性肝损伤中起关键作用[15]。TLR信号通路也可激活巨噬细胞的程序性死亡。TLR3 被双链RNA激活或TLR4被LPS激活后可募集TRIF，LPS联合zVAD刺激小鼠巨噬细胞会引起巨噬细胞TRIF与RIP3相互作用，进而发生程序性坏死，且此过程与LPS诱导的ROS系统活化有关[49]。Ma等[50]也在人巨噬细胞中得出同样的结论。上述研究提示，程序性坏死在巨噬细胞对肠道抗原等外来抗原的免疫应答中具有重要作用。

5 小结

综上所述，程序性坏死通路是调控巨噬细胞功能和死亡的关键通路，研究程序性坏死和凋亡的具体分子机制,进而分析在免疫性肝损伤过程中两者的交互调控具有十分重要的意义。靶向调控IKK复合物的活性或将对免疫性肝病的治疗提供广阔的治疗前景。该方向的进一步研究将为阐明自身免疫性肝病的发病机制提供新的理论依据，并为自身免疫性肝病开创新的治疗靶点。