黄珊瑜, 李小毛, 叶辉霞, 丁杰, 方莉

中山大学附属第三医院妇科(广东广州 510630)

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指从原发以及复发或转移癌灶脱落进入外周血循环的肿瘤细胞，目前认为CTC是肿瘤进展的早期事件，与肿瘤的转移、复发相关，并对恶性肿瘤的诊断、治疗及预后监测具有一定价值[1-2]。目前，已有多种检测循环肿瘤细胞的方法，其中基于上皮细胞粘附分子(EpCAM)检测的的CellSearch系统已获得FDA的认证，并广泛应用于包括乳腺癌等多种实体肿瘤中[3]。但在妇科恶性肿瘤包括子宫内膜癌患者中，CTC的应用价值仍在探索中。为此，本文分析探讨CTC分型检测与子宫内膜癌患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集中山大学附属第三医院妇科2015年11月至2018年11月就诊的患者，病例组纳入标准：行全子宫切除+双附件切除+盆腔淋巴结清扫±腹主动脉淋巴结清扫术手术、术后病理确诊为子宫内膜癌、术前10 d内行1次CTCs检测；病例组排除标准：术前行放疗患者、术前行化疗患者、术前行激素治疗患者、合并其他恶性肿瘤患者。共纳入83例子宫内膜癌患者；收集同期就诊的经手术后病理确诊的子宫良性病变患者，对照组纳入标准：经病理确诊为子宫良性病变(包括子宫平滑肌瘤、子宫内膜息肉、子宫腺肌病等)、术前10 d内行1次CTCs检测；排除标准：合并其他恶性肿瘤患者、随访半年发生恶性肿瘤患者，共纳入11例子宫良性病变患者。

1.2 CTCs检测方法 本研究采用广州益善生物技术股份有限公司开发的CanPatrolTMCTCs检测技术[4]，通过使用纳米过滤的方法分离CTCs，然后通过上皮细胞标志物(EpCAM、CK8、CK18、CK19)、间质细胞标志物(Vimentin、Twist)构成的探针进行多重RNA原位杂交(RNA-ISH)，荧光显微镜下进行循环肿瘤细胞的鉴定，在对CTCs进行计数、分型。根据细胞表型，仅表达上皮型标志物为上皮型CTCs；仅表达间质型标志物为间质型CTCs；而同时表达上皮型、间质型标志物的细胞为混合型CTCs。抽取患者外周血进行CTCs检测，并依据荧光染色情况，计数在100倍物镜下，上皮型、间质型、混合型CTCs数量情况。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0版软件进行统计学处理。非参数资料的统计描述用中位数及四分位数间距[M(P25,P75)]表示，二分类变量行Mann-WhitneyU非参数检验，等级资料行Kruskal-WallisH非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。采用Medcalc软件分析，用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线、Youden指数分析各分型CTCs计数在诊断良恶性的临界值。

2 结果

2.1 基本临床资料 纳入病例组共83例子宫内膜癌患者，平均年龄(53.6±8.8)岁，所有患者均在术前10 d内进行外周血CTCs检测，平均术前抽血时间为术前4.7 d，所有患者均行全子宫切除+双附件切除+盆腔淋巴结清扫±腹主动脉淋巴结清扫术，子宫内膜癌患者CTCs各分型分布见图1、表1。其中，Ⅰ期子宫内膜癌患者6例、Ⅱ期子宫内膜癌患者2例、Ⅲ期子宫内膜癌患者13例、Ⅳ期子宫内膜癌患者6例。其临床病理特征如表1，其中，Ⅱ型子宫内膜癌患者9例、组织学低分化子宫内膜癌患者18例。纳入对照组11例子宫良性病变患者，平均年龄(46.0±14.6)岁，所有患者均在术前10 d内进行外周血CTCs检测，平均术前抽血时间为术前1.6 d。

2.2 临床病理特征及CTCs分布情况 子宫内膜癌患者、子宫良性病变患者CTCs总数及各分型分布中位数、四分位数间距详见表2。在子宫良性病变患者中，CTCs检出率为36.4%(4/11)，其中上皮型CTCs、间质型CTCs检出率均为0%，CTCs总数、上皮型CTCs、混合型CTCs、间质型CTCs的中位数分别为：0.00个、0.00个、0.00个、0.00个。在子宫内膜癌患者中，CTCs总检出率高达95.2%(79/83)，CTCs总数、上皮型CTCs、混合型CTCs、间质型CTCs相应的中位数分别为：6.00个、0.00个、3.00个、1.00个。与子宫良性病变患者对比，子宫内膜癌患者CTCs总数、上皮型CTCs、混合型CTCs、间质型CTCs均较高，差异有统计学意义(2=20.51、8.62、14.36、14.85，P<0.05)。

2.3 CTC诊断良恶性的临界值 应用Medcalc软件进一步行CTCs总数、上皮型CTCs、混合型CTCs、间质型CTCs单因素诊断的ROC曲线分析发现，当CTCs总数>1、上皮型CTCs>0、混合型CTCs>1、间质型CTCs>0时，是诊断子宫内膜癌与子宫良性病变的临界值，具体分析如表3。以上诉标准诊断良恶性病变的分布情况如表4所示，诊断的敏感度为97.37%，特异度为50.00%，准确度为83.30%，阳性预测值为89.16%，阴性预测值为81.82%。

图1 子宫内膜癌患者CTCs各分型分布

表1 子宫内膜癌患者临床病理特征

2.4 CTCs数目、分型与临床病理特征关系 将83例子宫内膜癌患者按术前肿瘤标志物包括CA125水平及CA199水平、分期、分型、分级、以及是否脉管浸润、神经侵犯、深肌层、宫颈侵犯、附件转移、淋巴结转移、腹水情况分层，分析各分型CTCs分布差异。各分型CTC在临床病例特征中各分型中位数、四分位数间距分布见表5。

3 讨论

与肿瘤标志物检测、传统影像学检查等辅助检查技术相比，包括ctDNA、cfDNA、CTC等新兴液态活检技术因其便捷、无创等优势，已成为肿瘤实时监测有效手段之一，在多种实体肿瘤早期筛查诊断、预后判断及监测疗效[5]发挥重要作用，从而指导临床治疗决策。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在促进肿瘤细胞的迁移和侵袭中发挥重要作用[6]，侵袭能力强的肿瘤细胞间质标志物表达上调、上皮标志物表达下调，从而导致基于上皮细胞黏附分子(EpCAM)检测的CTC检测系统出现假阴性结果[7]。此外，有证据表明，间质CTCs与转移性肿瘤治疗效果[8]、预后不良相关[9]。为此，本研究应用联合上皮标志物、间质标志物的新型CTC监测技术——CanPatrolTMCTCs检测技术[4]，对循环肿瘤细胞进行检测。

表2 子宫内膜癌与子宫良性病变各分型CTCs数目表 M(P25,P75)

注：与子宫良性病变比较P<0.05

表3 CTC总数及各分型诊断良恶性的效能表

表4 良恶性病变诊断结果分布四格表 例

表5 各分型CTC子宫内膜癌临床病理特征关系 M(P25,P75)

虽然CTC在包括乳腺癌、胃癌等多种实体肿瘤中广泛临床应该，但其在妇科恶性肿瘤，包括子宫内膜癌中的价值仍在探讨中。已有部分学者对CTC与子宫内膜癌患者进行临床病理特征分析，其中，Kolbl等[10]选用CK19、Mig7基因进行CTC检测发现，在子宫内膜样腺癌患者CTCs中，CK19、Mig7基因表达水平与肿瘤分期相关。Bogani等[11]对28例高危子宫内膜癌患者CTCs研究发现，CTC阳性与肿瘤肌层浸润、淋巴结转移相关。与之相反，有学者研究发现，Walter等[12]在妇科恶性肿瘤患者骨髓中普遍存在肿瘤细胞，但在子宫内膜癌、外阴癌患者中并未发现肿瘤一患者的临床病理特征与肿瘤细胞有相关性，这与本研研究发现结果一致，分析原因与乳腺癌、卵巢癌相比，来源于子宫内膜癌或外阴癌的肿瘤细胞启动转移性再生的可能性更小。因此，在妇科恶性肿瘤尤其是子宫内膜癌中，循环肿瘤细胞与临床病理特征关系及其分子机制仍值得进一步研究。

运用CanPatrolTMCTCs检测技术在包括肝癌、食管癌、鼻咽癌、胰腺导管癌、直肠癌等实体肿瘤中检测CTCs发现，CTCs总检出率在78.5%～99.1%[13-14]，与本文不一致的是并未发现有良性或健康对照组有CTC检出情况，肿瘤患者中CTCs的检出与部分临床病理特征包括分期、肿瘤的大小、远处转移、肿瘤标志物水平有关，其中混合型、间质型CTCs与肿瘤分期、转移关系更显著[15-18]。但与之相反，也有学者研究[19-20]出现与本文相似的结果，在肝细胞癌中，CTC数目、分型与肿瘤患者临床病理特征包括肿瘤大小、分期等均无相关性，并且相比肿瘤标志物并不能良好预测肿瘤复发。我们的研究结果发现，CanPatrolTMCTCs技术检测子宫内膜癌患者CTCs检出率高，但其在良性患者中，仍有一定的假阳性率，通过上调CTCs阈值，可提高诊断子宫良恶性病变的敏感性，但其准确度、特异度仍较低，分析原因不排除存在诸如良性疾病恶性行为的子宫内膜异位症等有浸润转移倾向的疾病导致的假阳性。另外，我们并未发现CanPatrolTMCTCs技术检测各分型CTCs数目与子宫内膜癌临床病例特征有相关性，考虑因选取的上皮细胞标志物(EpCAM、CK8、CK18、CK19)、间质细胞标志物(Vimentin、Twist)对子宫内膜癌鉴别的特异性低，导致子宫内膜癌患者总体CTCs基数较低而导致。因此我们认为，CanPatrolTMCTCs检测技术在子宫内膜癌患者中的应用仍有待进一步改进。