刘春丽， 张洁， 郭霞， 梁媛， 张圣林

承德医学院附属医院 1耳鼻喉科, 2肿瘤科(河北承德 067000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的发生与爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus，EBV)感染密切相关[1-2]，EBV主要通过癌蛋白潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达促成肿瘤的发生。通过对多种肿瘤进行的大规模的miRNA筛选显示，LMP1可以调节miRNA的表达模式，如下调miR-203、miR-29b，上调miR-155、miR-21、miR-10b，从而对细胞迁移、增殖、凋亡产生多效作用[3]。体外实验证明LMP1通过Twist1上调了鼻咽癌细胞系C666.1中miR-10b的表达，增强了移动性并促进体外迁移和侵袭以及体内携带肿瘤裸鼠的死亡[4]。鼻咽癌患者活检组织标本中miR-10b是否通过LMP1、Twist1调控及其与鼻咽癌增殖与迁移的关系并没有报道。本研究通过检测鼻咽癌活检组织中miR-10b、LMP1、Twist1的表达情况，探讨三者的相关性。通过检测内皮细胞和基质细胞标记物，评估miR-10b在体内对鼻咽癌细胞发生和发展的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集承德医学院附属医院2017年6月至2018年9 月进行治疗的79例鼻咽癌患者，所有患者均经组织学检查证实为原发性鼻咽癌，在手术前没有接受过放疗、化疗或生物治疗;没有切除或转移性疾病的病史;没有患其他原发性肿瘤。所有患者均有完整的临床资料。男48例，女31例；平均(46.23±2.55)岁，其中12个活检组织标本是青年型(年龄<30岁的患者)。鼻咽癌的临床分期按照美国癌症联合会/国际抗癌联盟(AJCC/UICC)确定TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期13例，Ⅲ期48例，Ⅳ期18例。有淋巴结转移52例，无淋巴结转移27例。组织学类型根据世界卫生组织2005版确定组织切片，低分化或未分化鳞状细胞癌63例，中/高分化鳞状细胞癌16例。其中12个活检组织标本是青年型(年龄<30岁的患者)。所有患者均已签知情同意书。鼻咽癌的临床分期按照美国癌症联合会/国际抗癌联盟(AJCC/UICC)确定TNM分期，组织学类型根据世界卫生组织2005版确定组织切片。另35个来自鼻咽的正常活检样本用作对照。

1.2 实验试剂 TRizol试剂:英杰生命技术有限公司提供; 一抗：抗E-钙黏蛋白，抗β-连环蛋白，抗纤连蛋白，抗N-钙黏蛋白，抗波形蛋白和抗MMP-9(目录号分别为ab1416; ab22656; ab6328; ab18203；ab8978; ab58803)兔抗鼠多克隆二抗抗体(目录号ab6728)均购自美国Abcam公司。

1.3 PCR检测miR-10b的表达水平 按照试剂说明书的步骤，用TRizol试剂裂解组织，氯仿抽提，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，取各组RNA，用紫外分光光度计测RNA浓度及OD260/260值，取OD260/280在1.8～2.0样品进行反转录成cDNA, 于-80℃保存备用。GAPDH作为内参对照。GAPDH引物序列：上游为5′-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′,下游为5′-CGCCCAATACGACCAAATCC-3′,产物长度122 bp，循环次数35次，退火温度60℃。miR-10b引物序列：上游为5′-ACACTCCAGCTGGGTACCCTGTAGAA-3′，下游为5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′，产物长度65 bp，循环次数40次，退火温度61℃。用2-ΔΔCt方法对组织样本目的基因的相对表达量进行分析。

1.4 PCR检测miR-10b与Twist1、LMP1表达水平 Twist1上游引物序列5′-CAAGCTGCAGCTATGTGGC-3′，下游引物序列5′-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGG-3′，产物长度298 bp，循环次数35次，退火温度60℃。LMP1上游引物序列5′-ACACACTGCCCTGAGGATG -3′，下游引物序列5′-TGAGCAGGAGGGTGATCA-3′，产物长度298 bp，循环次数35次，退火温度60℃。RNA提取方法和每个样本的相对表达量分析同1.3。根据Twist1和LMP1的相对表达水平，将79例鼻咽癌患者分为3组，第一组(即组1)为Twist1阴性表达，与LMP1的表达谱无关的病例，共35例。第二组(即组2)为Twist1阳性表达和LMP1的阴性表达的病例，共19例。第3组(即组3)为Twist1和LMP1同时阳性表达的病例，共25例。用PCR检测miR-10b 与Twist1、LMP1的表达水平，分析三者的相关性。

1.5 Western法检测E-钙黏蛋白、β-连环蛋白、纤连蛋白、N-连环蛋白、波形蛋白和MMP-9水平 按照试剂盒说明书，用裂解液裂解各组的标本，BCA 法测定蛋白浓度，各样品上样量20 μg，在10%分离胶(恒压120 V)和5%浓缩胶(恒压80 V)中进行电泳，2 h后将凝胶上的蛋白湿转法转移至硝酸纤维素膜上。一抗(稀释液浓度1∶1 500) 室温下孵育膜1 h，常规洗涤。然后将膜与二抗(稀释液浓度1∶2 500)一起温育1 h，常规洗涤，显影。使用全自动蛋白质印迹分析系统记录免疫印迹结果。每个条带的密度用凝胶成像分析系统确定，β-肌动蛋白作内参。计算目的蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 miR-10b在鼻咽癌活检组织和鼻咽正常组织的表达水平 鼻咽癌活检组织中miR-10b的相对表达水平是88.6±0.75，正常组织miR-10b的相对表达水平是3.56±0.46，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 miR-10b的表达水平与Twist1和LMP1的相关性分析 79个原发性鼻咽癌活组织样本分别检测到33例和46例Twist1和LMP1的阳性表达。在鼻咽正常组织样本中, 所有35例患者的LMP1表达均为阴性，而仅在4例患者中检测到Twist1。本研究发现Twist1和LMP1阳性病例与miR-10b过表达显著相关(P<0.05)。如表1所示，同时表达LMP1和Twist1的病例(第3组)与只有Twist1阳性表达(第2组)和Twist1阴性表达(第1组)的病例相比较, miR-10b mRNA的相对表达水平更高,差异有统计学意义(组2和组3比较P=0.035，组1和组3比较P=0.013)。

2.3 上皮细胞和基质细胞标志物的表达水平 Western印迹分析法检测鼻咽癌组织、鼻咽正常组织中上皮细胞和间质细胞标记物的表达水平。如表2所示，鼻咽癌组织中E-钙黏蛋白和β-连环蛋白的表达水平显著低于鼻咽正常组织(P<0.05)。鼻咽癌组织中纤连蛋白、N-连环蛋白、波形蛋白和MMP-9的表达水平高于没有miR-10b表达的鼻咽正常组织(P<0.05)。

表1 分组后每组miR-10b的相对表达水平

注：*与组3比较P<0.05

表2 鼻咽癌组织和正常组织中上皮细胞标志物和间质细胞标志物的表达水平

注：*与正常组织比较P<0.05

3 讨论

鼻咽癌是鼻咽黏膜的恶性肿瘤，伴有早期远处转移和局部侵袭，在我国的广东、广西发病率很高[5]。目前随着诊断和治疗方法的改进，大多数早期鼻咽癌患者已成功治愈。然而，大多数中晚期患者由于肿瘤细胞的侵袭和转移5年生存率极低。资料显示30%～40%的鼻咽癌患者会在4年内发生远处转移，转移后预后变差，且易引起复发[6]。其原因是包括鼻咽癌细胞在内的癌细胞出现转移后，促进了上皮-间质转化(EMT)，以上皮标志物丧失-间充质标志物增多为特征，从而加速了迁移和侵袭[7-8]。

EMT是指上皮细胞转化为间充质细胞，是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和入侵能力的一种重要的生物学细胞过程。EMT后，细胞形态发生改变，细胞增多、增厚，表面纤维和伪足增加。上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和β-连环蛋白的表达减少，而间充质细胞标志物纤维蛋白，N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达增加，增强了细胞迁移能力和肿瘤转移的能力[9-10]。EMT后，处于静止状态的上皮细胞变为间充质细胞后即具有很强的迁移能力。此外，蛋白水解酶，如MMP-9，可以降解基底膜，进一步促进细胞侵入细胞外基质中。鼻咽癌细胞在EMT的过程中，这些细胞标记物有类似的变化，尽管导致这些变化的机制仍不清楚，但在转移进展的早期阶段起着关键作用。因此，更好地了解鼻咽癌转移的分子模式，寻找有效的靶向治疗，尽可能地减少肿瘤细胞的侵袭和转移，对于开发有效的治疗鼻咽癌的新策略，更好地治疗中晚期鼻咽恶性肿瘤是至关重要的。

微小RNA(miRNA)是一种高度保守的单链小分子非编码RNA，参与调节多种细胞途径，除具有与细胞生长发展和分化相关的关键调节功能外，也充当癌基因或肿瘤抑制因子[11]。在鼻咽癌患者中，已观察到失调的miRNA表达，并且发现特异性miRNA的异常表达与鼻咽癌细胞的转移和侵袭相关。目前，发现了35种miRNA在鼻咽癌组织中的表达水平发生了变化，其中包括miR-10b[12]。

Horikawa等[13]在鼻咽癌细胞株的研究中发现， EB病毒编码的潜伏膜蛋白LMP1在细胞培养模型中通过NF-κB途径诱导转录调节因子Twist1的过表达，导致鼻咽癌的转移，Li等[14]报道了miR-10b在C666-1 鼻咽癌细胞系中，EB病毒阳性的潜伏膜蛋白-1(LMP1)表达诱导Twist1表达高水平的miR-10b，miR-10b的上调又增加了细胞的移动性，但在LMP1沉默的C666.1细胞中如果诱导miR-10b过表达，也可以明显促进体外伤口愈合和跨膜侵袭以及体内携带肿瘤裸鼠的死亡[15]。这些发现表明miR-10b在体外可促进鼻咽癌的转移。但在鼻咽癌患者体内miR-10b是否也可以通过LMP1及Twist1促进癌组织的生长与扩散并无报道。

本研究通过检测鼻咽癌患者鼻咽组织及正常人鼻咽组织发现，鼻咽癌患者鼻咽组织中miR-10b高表达，明显高于正常组，且miR-10b在组3(Twist1和LMP1同时阳性)的表达明显高于单阳性组2(Twist1阳性LMP1阴性)或阴性组1(Twist1阴性)(分别为P=0.035，P=0.013)。即表达/或不表达Twist1与同时表达LMP1和Twist1的样品miR-10b具有显著的区别。结果表明LMP1促成miR-10b的过表达，与鼻咽癌细胞系的研究[15]结果一致。研究还发现鼻咽癌组织中上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和β-连环蛋白的表达低于正常鼻咽上皮组织，而基质细胞标志物纤连蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9的表达明显高于鼻咽上皮组织。上皮细胞标志物的减少，可以减弱细胞-细胞黏附，从而减少细胞黏附和增加细胞基底膜运动。而基质细胞标志物的增加，可以增强癌细胞的迁移能力，从而促进鼻咽癌细胞的EMT，促进肿瘤细胞的侵袭和凋亡[16]。已知转录因子KLF4是miR-10b的直接靶点，miR-10b可通过靶向转录因子KLF4来调节EMT[17]，结果说明在鼻咽癌患者体内过表达的miR-10b促进了癌细胞的EMT。

总之，鼻咽癌活检组织标本中高水平的LMP1和Twist1的同时表达可以诱导miR-10b高表达，即LMP1通过转录因子Twist1上调miR-10b的水平。miR-10b的升高可以使上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和β-连环蛋白的表达下降，使细胞-细胞黏附能力减弱，增加细胞运动；基质细胞标志物纤连蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9增加，细胞迁移能力增强，来促进鼻咽癌细胞的EMT，从而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。本研究为miR-10b作为治疗鼻咽癌的关键靶点，为开发新的靶向治疗提供实验基础。但其确切机制还需进一步研究。