■周海霞 房庆峰 李颖颖 罗塞博 戴南平 白寅霜 赵 伟

(1.德州学院生命科学学院 功能性生物资源利用与开发省高校重点实验室，山东德州253023；2.山东福洋生物科技有限公司，山东德州253100)

葡萄糖酸钠在建筑、医疗、食品行业中有着广泛 应用，随着经济的快速发展其产量急剧增加。葡萄糖酸钠的工业生产是以玉米淀粉为主要原料，在提取获得葡萄糖酸钠后，还产生大量剩余母液，这部分液体残糖异糖含量高[1]，BOD(生物需氧量)高，作为饲料销售价值低，直接排放造成环境污染。酵母菌和乳酸菌具有重要的益生作用，在食品或饲料中应用广泛。酿酒酵母是优良的天然单细胞蛋白质，含有丰富的维生素和矿物质，具有促进食品的消化吸收，促进生长，提高免疫力的作用[2]。双歧杆菌和乳杆菌是人类和动物益生菌的主要代表，具有抗菌抑菌、促进营养物质分解、增强免疫、预防肿瘤等作用[3-4]。即使是益生菌的发酵产物和灭活菌体也能发挥益生作用[5-6]。葡萄糖酸钠母液益生菌再发酵研究较少，只有少量关于葡萄糖酸钠作为饲料成分具有益生作用的研究[7]。本研究拟以提取葡萄糖酸钠后的母液作为营养物质，利用酿酒酵母菌、双歧杆菌及乳酸菌独特的糖类发酵能力，探讨益生菌发酵葡萄糖酸钠母液的可行性。以期在获得大量益生菌提高葡萄糖酸钠母液附加值，为葡萄糖酸钠母液再利用提供方向。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用葡萄糖酸钠母液从山东福洋生物科技股份有限公司葡萄糖酸钠母液存放池中直接获得，深褐色，含白色沉淀。

A 培养液：葡萄糖酸钠母液25 g、(NH4)2SO42 g、MgSO40.6 g、MnSO40.25 g、水1 000 ml，pH 值6.2～6.6，121 ℃高压蒸汽灭菌。

B培养液：葡萄糖酸钠母液25 g、酵母膏3 g、蛋白胨5 g、水1 000 ml，pH值6.8～7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌。

C 培 养 液：(NH4)2SO42 g、MgSO40.6 g、MnSO40.25 g、水1 000 ml，pH值6.2～6.6，灭菌后加入未灭菌葡萄糖酸钠母液25 g。

0.5%溴甲酚紫：溴甲酚紫0.5 g、水100 ml，用时按照10%的量添加到培养液中灭菌。

酿酒酵母由酵母粉中分离获得，乳杆菌由乳酸菌酸奶发酵剂中分离获得。双歧杆菌从双歧杆菌酸奶发酵剂中分离获得。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄糖酸钠母液培养液利用的初步测定

①分别配制含有溴甲酚紫的A、B、C 培养液，装入50 ml螺口玻璃瓶中。121 ℃，灭菌20 min，灭菌后立即拧紧带丁基橡胶塞的厌氧瓶盖。

②分别按照10%的量接种酿酒酵母菌、乳酸菌、双歧杆菌、混合菌双菌1（bio-microbial inoculum，BM1，双歧杆菌∶酿酒酵母=1∶1）和双菌2（BM2，乳酸菌∶酿酒酵母=1∶1）。

③37 ℃，培养12～48 h，在丁基橡胶赛上插入一次性无菌注射器，收集产生的气体，防止压力过大，观察变色、产气和菌体生长情况。出现变色、产气、镜检有菌体生长现象的均标记为阳性。

1.2.2 葡萄糖酸钠母液灭菌温度优化

①配制含溴甲酚紫的A 培养液，分装于螺口玻璃瓶中，121 ℃，灭菌20 min，做不长菌的阴性对照。

②取2.5 g/100 ml葡萄糖酸钠母液，直接放无菌三角瓶底部，于恒温水浴锅及高压灭菌锅中按70、80、90 ℃处理1 min、115 ℃处理30 min、120 ℃处理15 min。

③将杀菌消毒后的葡萄糖酸钠母液10 ml 与高压蒸汽灭菌的A 液90 ml 在无菌条件下分别混合均匀，接入酿酒酵母菌、乳酸菌、双歧杆菌、双菌剂1 和双菌剂2，37 ℃，培养24～48 h，观察培养基是否变色、产气，并镜检是否有菌生长。

1.2.3 生长曲线的测定

①挑取酿酒酵母、双歧杆菌和乳酸菌分别接种于A 培养液中，摇床震荡过夜培养，以获得处于生长对数期的活化种子液。

②将活化好的酿酒酵母菌、乳酸菌、双歧杆菌、双菌剂1 和双菌剂2 按10%的接种量接入A 培养液中，并置于37 ℃下培养箱中培养；每隔4 h取样，10倍梯度稀释，并涂布平板。

③以培养时间（h）为横坐标，各时间所对应的活菌浓度（CFU/ml）为纵坐标，绘制各菌的生长曲线并计算代时[8]。

式中：t1、t2——选取微生物进入指数生长期后，细胞数量增长最快的两个时间点（h）；

x1、x2——t1、t2时间点分别对应的每毫升培养液中可培养的细胞数量（CFU/ml）。

2 结果

2.1 葡萄糖酸钠母液培养液利用的初步测定

将酿酒酵母菌、双歧杆菌、乳酸菌、双菌剂1、双菌剂2分别接种于121 ℃高压蒸汽灭菌后的含溴甲酚紫的A、B 培养液和C 培养液中，于37 ℃下培养。颜色由紫色变成黄色，并产生气体，镜检出现大量菌体的培养物均在表1标记为阳性。

表1 中可以看出，B 培养液按照5 种方式接菌后都出现产酸、产气和菌体生长现象；A 培养液都没有产酸产气现象，镜检几乎无菌体发现，延长培养时间，无变化；接菌的C培养液，产气和产酸迅速，镜检后发现不仅接入的菌能够生长，而且还有其他形状的杆菌和酵母菌生长。

对比A、B 培养液培养结果得出，121 ℃高压蒸汽灭菌的A 培养液中葡萄糖酸钠母液的营养物质、无机氮盐和矿物质不足以供试验所用3 种益生菌单一或混合生长，可能需要提供生长因子或天然有机氮源才能生长。对比A、C 培养液培养结果得出，在(NH4)2SO4、MgSO4、MnSO4存在下，未经加热的葡萄糖酸钠母液能够供益生菌生长，而121 ℃灭菌后的则不能。需要对A 培养液的灭菌温度进一步优化。

2.2 葡萄糖酸钠母液灭菌温度优化

鉴于121 ℃高压蒸汽灭菌可能破坏了葡萄糖酸钠母液中的生长因子成分，对葡萄糖酸钠母液进行70、80、90 ℃巴氏杀菌和115、120 ℃灭菌，观察酿酒酵母菌、双歧杆菌、乳酸菌和杂菌生长，以确定较合适的灭菌温度，进一步验证葡萄糖酸钠母液的生长作用。试验结果见表2。

表1 各菌在葡萄糖酸钠母液中的生长情况

表2 葡萄糖酸钠母液不同灭菌温度对微生物生长的影响

由表2 结果看出，用70～90 ℃的巴氏水浴消毒法加热葡萄糖酸钠母液后，酿酒酵母菌、双歧杆菌、乳酸菌都能够生长，但是镜检时发现大量形态差异大，运动能力强的杆菌，判断是葡萄糖酸钠母液中存在的极少量杂菌大量繁殖而来，巴氏消毒不能有效杀死这些杂菌。120 ℃灭菌能够杀死杂菌，但是3 种益生菌却不能生长。只有115 ℃灭菌时，杂菌得到有效控制，3种益生菌能够正常生长。综上，A培养液比B培养液更有利于生产上使用，引入物质少，考虑效益，所以用A 培养液。C 培养液加入没灭菌的葡萄糖酸钠母液，出现染菌现象，不能使用。因此后续试验采用115 ℃，30 min蒸汽灭菌A培养液进行生长曲线测定。

2.3 益生菌生长曲线测定

将10%体积的酿酒酵母菌、双歧杆菌、乳酸菌、双菌剂1、双菌剂2分别接种到A培养液后，测定生长曲线。为方便比较双菌剂中的酿酒酵母菌生长，酿酒酵母菌在37 ℃条件下培养。单菌培养曲线见图1～图3。

从图1酵母菌的生长曲线看出，酿酒酵母在A培养液中生长4 h左右进入对数期；培养至12 h，酿酒酵母菌到达稳定期，最高浓度为7.5×107CFU/ml。37 ℃培养时，酿酒酵母菌在A培养液中的代时约为1.50 h。

从图2双歧杆菌的生长曲线数据得出，双歧杆菌在37 ℃培养条件下，16 h时进入对数期；培养32 h达到稳定期，双歧杆菌活菌最高含量达到4.5×109CFU/ml。在A培养液，37 ℃培养，双歧杆菌生长代时为1.36 h。

图1 酿酒酵母菌在A培养液中的生长曲线

图2 双歧杆菌在A培养液中的生长曲线

图3 乳酸菌在A培养液中的生长曲线

乳酸菌单菌培养生长曲线见图3。在A 培养液中，37 ℃条件下，乳酸菌培养8 h进入对数期，12 h达到稳定期。乳酸菌浓度最高达到5.7×109CFU/ml，由计算得出，在A液培养液中，37 ℃条件下，乳酸菌生长代时为0.81 h。

酿酒酵母菌和其他菌在进行双菌培养时，有可能起到促进作用也有可能起到抑制作用[9]。本试验将双歧杆菌、乳酸杆菌分别和酿酒酵母菌混合，等体积制成双菌剂，接入A 培养液中培养，绘制各自生长曲线。

图4 BM1在A培养液中的生长曲线

图5 BM2在A培养液中的生长曲线

双歧杆菌和酿酒酵母菌混合接种到葡萄糖酸钠母液后，37 ℃培养，定时取样绘制生长曲线见图4。

从图4 中可以看出，37 ℃培养条件下，双歧杆菌和酿酒酵母菌两种菌混合培养比各自单独培养的生长曲线表现为适应期延长，稳定期拖后。混合培养时，双歧杆菌最高浓度达到1.8×108CFU/ml，代时为1.80 h；酿酒酵母菌最高浓度达到3.5×107CFU/ml，代时为2.10 h。双歧杆菌和酿酒酵母菌都比单独培养时浓度降低（4.3×109CFU/ml 和4.0×107CFU/ml），代时延长（0.44 h和0.60 h）。

乳酸菌与酿酒酵母菌等量混合后的菌液在A 培养液中的生长曲线见图5。

对比乳酸菌与酿酒酵母菌两种菌单独培养的生长曲线菌和混合培养生长曲线，可以看出混合后两种菌同样表现为适应期延长，稳定期拖后，浓度明显低于各自单独培养。乳酸菌与酿酒酵母混合培养时，乳酸菌最高浓度达到5.6×109CFU/ml，代时为1.42 h；酿酒酵母菌最高浓度达到3.8×107CFU/ml，代时为2.52 h，均比单独培养时浓度降低（0.1×109CFU/ml 和3.7×107CFU/ml），代时延长（0.61 h和1.02 h）。

3 讨论

3.1 葡萄糖酸钠母液培养液利用的初步测定

本试验所用葡萄糖酸钠母液，是以玉米淀粉为原料酶法生产葡萄糖酸钠提取产物后剩余的褐色液体。该液体经前期测定得出，固体含量50%，葡萄糖酸钠25%，总糖22%，其中单糖2%，麦芽糖5%，双糖和多糖15%左右，含有较多异糖，与其他方法生产葡萄糖酸钠残糖分析有相似之处[1]。葡萄糖酸钠母液中碳源含量较高，因此在试验中将其作为碳源利用。由于玉米本身营养丰富，玉米淀粉的生产过程中不可避免地要带入其他营养物质，酶法生产葡萄糖酸钠过程结束后，这些营养物质将被保留在剩余的溶液中，因此在将葡萄糖酸钠母液作为碳源使用时，还需要考虑其它营养物质对微生物生长是否有影响。

酿酒酵母菌、双歧杆菌和乳酸菌这3种益生菌具有利用葡萄糖、半乳糖等单糖和一些低聚糖的特性，能在只有生长因子、碳源、铵盐和矿物质元素的简单培养基上生长，是利用葡萄糖酸钠母液的理想菌株。121 ℃高压灭菌后，葡萄糖酸钠母液加入酵母粉和蛋白胨后可以使本试验的3种益生菌生长，推断出葡萄糖酸钠母液可以作为碳源。121 ℃高压灭菌后，葡萄糖酸钠母液加入无机盐不能使3种益生菌生长，而未灭菌葡萄糖酸钠母液加入无机盐能够使3 种益生菌单独生长或混合生长，同时伴有杂菌生长。此处试验不能排除是杂菌在生长过程中提供了某些物质供给接入益生菌生长，需要进一步证实，但更有可能葡萄糖酸钠母液不仅仅是提供微生物生长所需碳源，其中可能存在某些生长因子，为接入菌株正常生长代谢所必需，121 ℃高压蒸汽灭菌破坏了葡萄糖酸钠母液中的生长因子成分，造成接入的菌株不能生长。

3.2 葡萄糖酸钠母液灭菌温度优化

从巴氏消毒和高温蒸汽灭菌的结果可以得出，葡萄糖酸钠母液不仅仅提供微生物生长所需碳源，其中存在某些生长因子不能耐受121 ℃高压蒸汽灭菌。低温杀菌虽然可以最大程度保留其营养成分，特别是生长因子不受损坏，但不能有效排除杂菌干扰试验。115 ℃，30 min 蒸汽灭菌可以在杀灭其中杂菌的基础上，仍然使葡萄糖酸钠母液营养成分不被破坏，供给酿酒酵母菌、双歧杆菌、乳酸菌益生菌的生长。对于葡萄糖酸钠母液无机盐培养基来说115 ℃，30 min是最适合的灭菌温度。

3.3 益生菌生长曲线测定

本试验中两种菌的混合培养比单独培养时，生长代时有所延长，总生长量有所下降，酿酒酵母菌并没有为双歧杆菌和乳酸菌生长提供额外营养物质，甚至相互抑制。这可能与两种菌共同生长时竞争营养物质和释放抑制产物有关[10-11]。

培养液不同，培养条件不同都会导致同一菌的代时和菌体生长量的差异。有报道乳酸菌与酿酒酵母菌混合培养试验中，乳酸菌浓度达到2.8×108CFU/ml[9]；粪肠球菌和酿酒酵母混合培养时，两者浓度分别达到3.8×108CFU/ml 和2.4×108CFU/ml[12]，相比较本试验双菌培养中，乳酸菌浓度可达到5.6×109CFU/ml，相对较高；酿酒酵母菌浓度可达到3.8×107CFU/ml，浓度略低。由于酿酒酵母菌是优质单细胞蛋白，其生长能提高发酵液中的蛋白质含量，增加发酵产物作为饲料的营养价值，因此作为饲料用途，将酿酒酵母菌与其它益生菌混合培养仍具有一定优势。经过上述益生菌发酵后，溶液中仍然存在部分葡萄糖酸钠，已有研究表明葡萄糖酸钠可提高肉鸡的生长性能，降低料肉比，提高饲料效率，同时改善肠道微生物菌群结构[7]。因此本试验获得的益生菌发酵液，具有较高的饲料应用价值。

4 结论

本试验利用葡萄糖酸钠母液总糖含量较高兼有生长因子的特点，将其作为营养物质，配制含无机盐的培养液，用酿酒酵母菌、双歧杆菌、乳酸菌进行发酵。试验表明葡萄糖酸钠母液25 g、(NH4)2SO42 g、MgSO40.6 g、MnSO40.25 g、水1 000 ml、pH值6.2～6.6，115 ℃，灭菌30 min，酿酒酵母菌（7.5×107CFU/ml）、双歧杆菌（4.5×109CFU/ml）、乳酸菌（5.7×109CFU/ml）都能较好的生长；微生物混合培养浓度虽然不如单菌培养，但是作为饲料仍然具有较高的应用价值。

通过添加少量无机盐的方式让酿酒酵母菌、双歧杆菌、乳酸菌三种益生菌利用葡萄糖酸钠母液发酵，成本不高，但提高葡萄糖酸钠母液作为饲料的营养价值，增加了附加值。本试验为葡萄糖酸钠母液再利用提供一个高效、低成本的参考方法。