■许诗亮 王士政 徐 瑞 赵雨梦 黄璞祎

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院，黑龙江哈尔滨150040)

蛇鮈(Saurogobio dabryi)，属鲤形目，鮈亚科，蛇鮈属，是一种中下层小型杂食鱼类，分布广泛，因其数量多，个体肥壮，味道鲜美而深受消费者喜爱。随着蛇鮈消费需求的不断增加，蛇鮈的人工养殖技术开始受到更多关注[1]。而在水产养殖中一般使用配合饲料来控制成本，但配合饲料口感与天然饲料的较大差别导致部分鱼类摄食兴趣不高、生长速度受限。诱食剂作为一种非营养添加剂，具有促进摄食、提高消化率与生长率的特点，是解决上述问题的良好途径，现已广泛应用于水产养殖中。

嗅电图是研究嗅觉反应的重要指标，是在嗅上皮上记录到的一种电位变化，也是研究诱食剂效果的一种有效方法。目前国外关于嗅电图的研究多集中于信息素与毒理学方面的研究[2-3]，国内的相关研究少有报道。另外近年来对于水产诱食剂的研究方法多使用触球法、迷宫法和摄食生长法，嗅电图法的相关报道也较为少见。本实验以蛇鮈为对象，采用嗅电图法，研究目前几种常用动植物提取物诱食剂（摇蚊幼虫、蚯蚓、甘草、陈皮）对蛇鮈的诱食效果，通过研究蛇鮈嗅电变化评价诱食剂的诱食效果，为进一步探究诱食剂作用机理和发展蛇鮈养殖业提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

丁香酚溶液：纯度99%，购于哈尔滨本地药店，加入蒸馏水稀释成45 mg/l的溶液。

三碘季胺酚：取三碘季胺酚粉末加入蒸馏水稀释成40 mg/l的溶液（上海源叶生物科技有限公司公司）。

摇蚊幼虫与蚯蚓提取液：新鲜摇蚊幼虫与蚯蚓购于哈尔滨市道外花鸟鱼市场，将购得的摇蚊幼虫和蚯蚓分别清洗后加入等质量的蒸馏水后以10 000 r/min的转速匀浆3 min，之后以3 000 r/min 的速度离心5 min 取上清液，得到0.5 g/l 的摇蚊幼虫及蚯蚓提取液，分别稀释为0.05、0.01、0.005 g/l 的足量溶液，在4 ℃下保存备用。

甘草与陈皮提取液：购于哈尔滨市本地药店，将购得的200 g 甘草和200 g 陈皮分别加入2 L 水在沸腾状态下进行煎煮30 min，倒出药液后再加入2 L 水再次在沸腾状态下煎煮30 min，将两次得到的药液合并作为浓度为0.05 g/l 的提取液，取一部分稀释为足量0.01、0.005 g/l的溶液，在4 ℃下保存备用。

所有试剂均为现用现配。

1.2 实验动物

健康野生蛇鮈30尾，2019年4月购自黑龙江省哈尔滨市松花江周边渔民，体长(15.45±1.10) cm，体重(22.32±1.40) g。饲养水用曝气24 h以上的自来水，在玻璃缸中暂养5 d 后用于正式实验，每天更换1/2 的已曝气的水，期间不投食。期间气泵充气，保证溶氧不低于6 mg/l。

1.3 主要实验仪器

实验中主要实验仪器为RM6240 多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂）、FSH-II型高速电动匀浆器（江苏省金坛市医疗仪器厂）、LDZ4-2 自动平衡离心机（江苏省金坛市医疗仪器厂）。

1.4 EOG实验方法

分别将摇蚊幼虫提取液、蚯蚓提取液、甘草提取液和陈皮提取液稀释为足量的0.05、0.01、0.005 g/l的溶液，实验过程中水温为17 ℃。

实验前随机选取10尾生理状况良好的蛇鮈个体在45 mg/l的丁香酚溶液中浸泡20 min使其麻醉至第四阶段[4]。待鱼体麻醉后，向其背部肌肉注射10 ml三碘季胺酚溶液将其固定。用解剖剪剪开鱼头部左侧前后鼻孔间的表皮，暴露嗅表皮。将鱼体放入事先准备好的玻璃缸中，保持悬空固定。将输液器软管放入口腔中，不断通入去氯自来水，保持其稳定呼吸状态。用相同规格的银丝作为电极，记录电极接触嗅表皮，参考电极接触同侧眼眶上方，鱼体接地。

电极与RM6240 多道生理信号采集处理系统相连记录电位变化。实验开始后，用另一套输液器向暴露的嗅表皮滴加诱食剂溶液或冲洗液，两次滴加间隔5 s，流速约为0.6 ml/min。以滴加诱食剂溶液产生的EOG振幅作为实验组，去氯自来水引起的电位变化作为对照组。每种浓度的诱食剂溶液连续滴加3次后，用装有去氯自来水的注射器冲洗嗅囊及全身约1 min，待鱼体呼吸及嗅电变化状态稳定后开始下一组实验，按照表1 所示顺序进行滴加，以减少不同诱食剂之间的干扰以及脱敏现象。在数据记录过程中，同种溶液对同一个体产生的EOG 振幅差异超过20%的数据弃用。

振幅测量方法是取峰电位与静息电位差值作为EOG幅值（见图1）。

图1 EOG波形

1.5 数据处理

使用RM6240USB2.0z 软件记录EOG，通道模式设置为生物电，扫描速度200 ms/div，灵敏度5 mV，时间常数0.2 s，滤波频率30 Hz，导联关闭，低通滤波15 Hz。

以对照组EOG 幅值为100%，求其他诱食剂溶液的相对刺激效应（相对刺激效应=EOG幅值/对照组），实验结果采用“平均值±标准误”（M±SE）表示。

利用SPSS Statistic 21 软件对数据进行双因素方差分析、相关性检验与多重比较。

2 结果

2.1 不同诱食剂对蛇鮈诱导的EOG波形图(见图2)

从图2 中可以看出，当嗅表皮接触刺激溶液时，首先由静息电位迅速上升，随后下降形成峰电位，之后继续下降至低于静息电位水平，最终缓慢恢复至静息电位。不同种类、浓度的刺激液形成的峰电位值有所不同，但形状基本相似。

2.2 不同诱食剂对蛇鮈的诱食效果比较

图2 诱食剂嗅电波形

相关性分析表明（见表1），诱食剂种类与相对刺激效应显著相关（P＜0.05）。纵向比较下，摇蚊幼虫提取液、蚯蚓提取液、甘草提取液和陈皮提取液四种诱食剂产生的相对刺激效应与浓度产生正相关，即浓度越高产生的相对刺激效应越高；由表1 可知，横向比较下，在浓度为0.05 g/l 和0.005 g/l 时：摇蚊幼虫提取液＞甘草提取液＞陈皮提取液＞蚯蚓提取液；在浓度为0.01 g/l 时：甘草提取液＞摇蚊幼虫提取液＞陈皮提取液＞蚯蚓提取液。由表2可知，总体而言诱食效果：摇蚊幼虫＞甘草＞陈皮＞蚯蚓。

表1 不同浓度的诱食剂相对刺激效应（mV）

表2 相对刺激效应多重比较（P值）

由表2 可知，摇蚊幼虫、甘草、陈皮与对照组相比，诱食效果极显著（P＜0.01）；蚯蚓与摇蚊幼虫相比，诱食效果差异极显著（P＜0.01），与甘草相比，诱食效果差异显著（P＜0.05）；蚯蚓诱食效果与对照组无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 嗅电图分析

目前关于鱼类诱食剂的研究中，主要的研究方法有摄食生长法、行为学法、电生理法等。摄食生长法是以鱼的摄食量为指标来评价诱食效果。摄食生长法需要的实验周期较长，不适用于诱食剂的筛选。行为学法包括触球法、迷宫法等。触球法相对客观,但无法确定鱼类的啄咬行为是摄食行为还是攻击行为;迷宫法装置过于复杂, 不利于大量应用;本实验采用的方法是电生理法中的嗅电图分析。嗅电图已被证明是研究鱼类对刺激物嗅觉敏感程度的有效方法[5]，与其他诱食剂研究方法相比，这种方法装置简便且受到鱼类行为和生理状态差异的干扰较小，可以广泛应用于诱食剂的研究之中。

在本实验中，当刺激物接触蛇鮈嗅囊时可以记录到清晰完整的波形，且不同刺激物形成的波形基本相同。但本实验中的波形与其他学者测量到的波形不同，在梁春梅等[6]对罗非鱼嗅囊对生物活性肽的EOG反应的报道中，EOG 波形被描述为单相负电位，滴加刺激时，EOG 先快速上升随后缓慢恢复至基线位置。作者认为此处差异与实验过程中正负电极的连接差异有关，不影响实验结果的有效性。

3.2 不同诱食剂对蛇鮈的诱食效果

鱼类摄食过程一般可以分为四个步骤，即启动阶段、搜索阶段、鉴定阶段和摄入阶段。在不同阶段鱼类所依赖的结构基础有所不同：①启动阶段，鱼类主要依靠视觉识别和嗅觉感受气味分子来发现远距离的食物，从而发觉食物的存在；②搜索阶段，依靠视觉和嗅觉的引导，鱼类开始朝着食物方向运动；③鉴定阶段，主要依靠味觉对食物进行接触识别；④摄入阶段，在确认食物可以摄入之后，鱼类开始不断摄入食物直至饱食[7]。水产诱食剂通过颜色、形状、气味、口味等不同方面给予鱼类嗅觉和味觉的物理或化学刺激，从而吸引鱼类摄食[8-9]。 大量研究发现鱼类对食物的选择主要取决于该种食物对其感觉器官的刺激强度大小以及遗传或记忆产生的偏好等[10]。这种偏好可以通过食性分析进行研究。

3.2.1 摇蚊幼虫和蚯蚓对蛇鮈的诱食效果

对嘉陵江蛇鮈的食性分析显示[11]，环节动物、节肢动物和藻类等是蛇鮈的偏好食物，这与本实验中摇蚊幼虫的显著诱食效果是一致的。在国内其他相关研究中可知，水产动物摄食引诱物质主要是氨基酸类、生物碱和核苷酸等物质[12-13]。在本实验中蚯蚓并未体现出显著诱食效果，可能是由于蚯蚓种类不同而在成分上有所差异，或蛇鮈因生活地域不同而对食物偏好有所不同导致。

3.2.2 陈皮和甘草对蛇鮈的诱食效果

中草药是我国具有优势的特色资源，具有天然、来源广泛、副作用小、成本相对较低等特点。1996 年梁思析等[14]归纳了日本学者对中草药作为水产诱食剂的有效尝试，认为中草药是一种具有广阔前景的诱食剂原料。我国学者对中草药诱食剂开展了大量的研究，发现中草药具有促进鱼类摄食、提高生长率、降低饵料系数的功能。其他学者通过摄食生长法、触球法、迷宫法的研究，证实陈皮、甘草、大蒜、洋葱、黄柏、丁香等中草药已被证实对鱼类有显著的诱食效果，这与本实验结论基本一致[15-16]。同时，徐俊杰等[17]发现甘草对鲫鱼有抑制摄食作用，与本实验结果有差异，可能与鲫鱼的生长发育阶段有关，也可能与鱼类种间差异、食性差异有关。

韩妍妍等[18]曾提出，中草药中含有的氨基酸、生物碱等物质可能是使其具有诱食作用的关键。已有学者通过化学成分分析发现，甘草主要活性成分是二氢茋类化合物、黄酮类化合物[19]，陈皮主要活性成分是生物碱类、柠檬苦素、黄酮类[20]。这些成分除了刺激鱼类嗅觉外，还具有一定的抗氧化、抗菌和抗癌活性等，可能在改善鱼体健康方面有一定功效。今后可对其主要活性成分进行研究，可能会为未来的诱食剂与饲料添加剂开发提供一定的参考。

另外，中草药诱食剂的处理方式多样，本实验中，通过煎煮的方法获取提取液，与陈思航等[21]的方法一致；有学者将中草药原料粉碎后进行匀浆，过滤后使用；也有学者将中草药原料直接超微粉碎后添加到饲料中用于生长实验[22]。不同处理方法可能会对结果有一定的影响。

4 结论

通过EOG法分别测定了0.05、0.01、0.005 g/l的摇蚊幼虫提取液、蚯蚓提取液、甘草提取液和陈皮提取液对蛇鮈的诱食效果，结果显示：①诱食剂的种类与浓度均对相对刺激效应有显著影响；②摇蚊幼虫、甘草和陈皮均对蛇鮈有显著诱食效果，摇蚊幼虫诱食效果最好，最佳浓度为0.05 g/l。建议将摇蚊幼虫、甘草和陈皮作为蛇鮈的诱食剂使用，但是三者混合使用效果仍需进一步的研究。不建议将蚯蚓作为蛇鮈的诱食剂使用。