任 艳，蒋文强

(绵阳市中心医院检验科，四川 绵阳 621000)

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)属假单胞菌属，革兰阴性杆菌，是引起医院感染的常见条件致病菌，常引起免疫力低下及ICU患者发生感染。根据中国CHINET细菌耐药监测网的报告发现，2005年～2016年PA的临床分离率均位于前列，是院内感染十分棘手的问题[1-3]。碳青霉烯类抗菌药物是治疗PA感染的有效药物，但随着该药物的广泛使用，耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, CRPA)逐渐出现，给临床治疗带来极大困难。2017年WHO将CRPA列为急需新药开发以控制感染的三大细菌之一[4]。本文主要从外膜通透性降低、主动外排系统过表达、产生抗生素灭活酶以及生物膜形成方面对CRPA的主要耐药机制做一综述，以期为临床合理用药及新型抗感染药物研发提供参考。

1 外膜通透性降低

PA属于革兰阴性菌，外膜作为PA细胞壁的主要成分，由磷脂和脂多糖(LPS)组成，内嵌有微孔蛋白(porins)。抗生素可通过细菌外膜上的微孔蛋白进入菌体，若微孔蛋白的含量显著减少或其结构发生改变，将导致抗生素无法进入细胞，从而形成耐药。PA细胞膜的微孔蛋白可分为四类：①非特异性孔蛋白(non-specific porins)，可允许大多数分子量较小的亲水性分子通过，如OprF；②特异性微孔蛋白(specific porins)，通过特异性位点结合特定的分子，如OprB、OprD、OprE、OprO及OprP；③门控蛋白(gated porins)，是一种可摄取离子复合物的离子调节外膜蛋白，如OprC和OprH；④外排泵孔蛋白(efflux porins)，是外排泵的重要组成部分，如OprM，OprN及OprJ[5]。其中，与碳青霉烯类耐药有关的微孔蛋白主要有特异性孔蛋白OprD及外排泵蛋白。OprD又分为OprD1、OprD2和OprD3，其中OprD2含有碳青霉烯类抗生素的特异性结合位点，是碳青霉烯类药物进入细胞的特异性通道。OprD2缺失或减少会使进入菌体的碳青霉烯类抗生素减少，从而使PA对该类抗生素产生耐药[6]。袁翊等对70株CRPA菌株进行blaIMP、blaVIM、oprD2基因检测，结果显示blaIMP阳性30株，blaVIM阳性13株，OprD2缺失70株，缺失率100%[7]。黄志卓等对191株CRPA进行分析发现，OprD2基因缺失161株，缺失率63.4%[8]。Fang等对国内临床分离的61株亚胺培南耐药PA进行研究发现，其中50株存在框架突变或提前形成终止密码子破坏OprD蛋白合成，5株OprD基因表达下降，剩下6株甚至未检测到OprD基因表达[9]。而将OprD基因重组于OprD缺陷菌株外膜蛋白脂质体中，亚胺培南通透性可增加5倍以上，同时MIC也降低，细菌耐药性也随之消除[10]。另外，插入序列(insertion sequences, ISs)通过引起OprD基因序列改变进而影响OprD基因功能，从而导致细菌对碳青霉烯类抗生素耐药[11]。Bocharova等发现插入序列ISPa195可引起OprD基因结构发生改变，与外排泵系统过表达共同导致PA对亚胺培南、美罗培南耐药[12]。由此可以看出，OprD蛋白减少或缺失在PA对碳青霉烯类抗生素耐药中发挥重要作用。

2 主动外排系统过表达

细菌主动外排系统可将菌体内的有毒物质排出体外，是细菌耐药的重要机制之一，可分为五大类：RND家族；MFS超家族；ABC超家族；SMR家族；MATE家族。其中，PA耐药性相关外排系统均属于RND家族，由内膜蛋白、外膜蛋白、膜融合蛋白组成[13]。内膜蛋白包括：MexB、MexD、MexF、MexY、MexK等，可识别药物，并将其主动转运出细胞膜；外膜蛋白包括：OprM、OprJ、OprN等，可形成门通道，具有孔蛋白的作用，使药物排除至菌体外。融合蛋白包括：MexA、MexC、MexE、MexY等，连接内、外膜，与其共同构成主动外排系统，开口于外膜，使药物直接泵出到菌体外。根据PA全基因组序列分析，推测该菌至少含有12种RND外排泵，其中4种(MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN及MexXY-OprM)与抗生素耐药性相关[14]。Cavalcanti等发现MexAB-OprM和MexXY-OprM过表达可导致PA对碳青霉烯类抗生素耐药[15]。Rostami等对19株碳青霉烯类抗生素高度耐药PA进行mexB、mexY、ampC、OprD基因扩增，结果显示12株呈mexB过表达，10株呈mexY过表达，7株ampC高表达，4株OprD低表达，其中7株mexB和mexY同时高表达，表明外排泵系统MexAB-OprM和MexXY-OprM在CRPA耐药中具有重要作用[16]。

外排泵MexAB-OprM的MexA、MexB及OprM蛋白均由操纵子mexO编码，而mexO又受到一系列调控基因(如mexR、nalC和nalD基因)的负向调控。mexR、nalC和nalD分别编码mexO操纵子阻遏蛋白MexR、NalC和NalD；若调控基因发生突变，则对mexO负向调控作用减弱，从而上调外排泵MexAB-OprM表达。Pan等利用外排泵抑制剂MC2071190对国内75株CRPA进行外排泵表型研究，结果显示13株表现为外排泵表型阳性[17]。通过PCR分析，其中10株检测出mexB和mexR、nalC及nalD。对PCR扩增产物进行测序分析，9株在NalC第71位氨基酸发生突变(甘氨酸→谷氨酸)，8株在NalC第209位发生突变(丝氨酸→精氨酸)，1株在NalD第158位氨基酸发生突变(苏氨酸→异亮氨酸)，8株在MexR蛋白上发生突变。由此可见，MexAB-OprM过表达在CRPA中扮演重要作用，而调控基因突变可能是MexAB-OprM过表达的主要因素。另外，有研究发现，MexAB-OprM外排泵对多数抗生素均发挥一定作用，若出现过表达现象，将会使美罗培南的MIC明显增高，但对亚胺培南的敏感性不会产生明显影响[18]。外排泵系统常引起中等程度耐药，但它们常常与其他耐药机制共同作用引起高水平耐药，从而增加PA治疗的复杂性。

3 产生抗菌药物灭活酶

CRPA产生的药物灭活酶主要是指碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是一种可以将碳青霉烯类抗生素灭活的β-内酰胺酶，主要分布于β-内酰胺酶的A、B、D类中。据氨基酸序列的不同，β-内酰胺酶可分为四类，即A、B、C和D类。A、C和D类酶均含有丝氨酸活性位点；而B类酶属于金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamasesm, MBL)，其发生作用需要锌离子参与，是CRPA的主要β-内酰胺酶，可由整合子或质粒介导[19]。A类酶包括KPC、SME、NMC、GES；B类酶主要包括IMP、VIM、SPM、GIM、SIM和NDM。C类酶主要指AmpC酶；D类酶包括OXA型酶。PA菌株中主要的碳青霉烯酶是MBLs，包括IMP、VIM、NDM、SPM和GIM 5种类型。IMP和VIM是MBLs中最常见的酶类，含有多种亚型，在众多亚型中，VIM-2型占主导地位；而NDM、SPM和GIM则只含有一种亚型，即NDM-1、SPM-1、GIM-1[20]。Rostami等对从烧伤病人分离的CRPA的主要耐药机制进行研究，发现15株(17.9%)呈blaIMP基因阳性，1(1.2%)株呈blaVIM阳性，未检测出blaSPM和blaNDM基因[16]。曾为伦等发现，60株CRPA菌株中，IMP阳性32株，VIM阳性16株，IMP和VIM同时阳性12株，表明该地区CRPA耐药机制以产碳青霉烯酶IMP、VIM为主[21]。刘洋等对24株CRPA进行碳青霉烯酶基因检测发现，其中11株携带VIM-2酶基因blaVIM-2，2株携带KPC-2酶基因blaKPC-2，未检测出blaIMP、blaNDM、blaOXA-48等其他基因型[22]。并且进一步分析显示，13株碳青霉烯酶阳性菌株中12株携带1种或2种质粒介导喹诺酮类耐药(PMQR)基因，表明碳青霉烯酶基因和PMQR基因存在一定的“共传播”现象，共同导致细菌多重耐药。产KPC或NDM型碳青霉烯酶CRPA比较少见，但有研究表明KPC酶是MBL阴性PA耐碳青霉烯类抗生素的主要原因之一[15]，因此仍需引起重视。

MBL编码基因位大多位于质粒、转座子或Ⅰ类整合子上，通过质粒、转座子和整合子的作用使耐药性在细菌间传播。Karampatakis 等发现blaVIM基因亚型以基因盒的形式位于Ⅰ类整合子不同位置上并可在细菌之间进行传播[23]。van der Zee等通过研究发现，碳青霉烯类抗生素耐药的多重耐药PA中存在一种复合转座子，该转座子携带含有blaVIM-2基因的Ⅰ类整合子，可在染色体和接合质粒间进行转位，并通过此种方式将耐药基因传播给其他PA菌株[24]。

4 生物膜形成

细菌生物膜(Bacterial biofilm, BF)是指附着于有生命或无生命物体表面相互聚集而形成的微菌落聚合物，由细菌和自身分泌的胞外基质组成。胞外基质包括胞外多糖、脂类、蛋白质、代谢产物和胞外DNA(eDNA)等，可介导细菌之间进行黏附，并组成生物膜的基本结构。当PA形成生物膜后，分泌的胞外多糖形成一种渗透屏障，阻碍了抗生素扩散至菌体内，从而增强其耐药性，并且容易导致感染转为慢性，迁延不愈[25]。这些渗透屏障使得生物膜内营养不足而导致细菌生长缓慢、代谢不活跃，进而增加持留菌(persister cells)的形成[26]。持留菌占生物膜细菌的1%左右，生长缓慢，代谢不活跃并且高度耐受抗生素[27]。一定浓度的抗生素能杀死大多数PA，持留菌因其细胞处于休眠状态，代谢缓慢，抗生素结合靶点合成减少等原因并不会被抗生素杀死，并能重新形成生物膜[28]。Maisonneuve等研究发现，在抗生素存在的条件下，持留菌并不会增殖；一旦去除抗生素，则可恢复生长[29]。因此，生物膜中的持留菌是导致慢性感染迁延难治的主要因素。研究发现从肺囊性纤维化病人中分离出的PA更易形成持留菌，这些持留菌高度耐受抗生素并且很可能发展成为多重耐药菌[30]。

近年来，随着医用高分子材料及病房各种置管操作的增多，使得生物膜PA在肺部囊性纤维化、尿路感染等患者及医疗器械、导管上分离较多[31]。PA通过自身分泌的DNA、蛋白及胞外多糖在肺上皮细胞表面形成生物膜，从而引起肺囊性纤维化患者发生慢性感染，并可耐受强化抗生素治疗且不受宿主炎性反应的影响[32]。张艳芳等对亚胺培南耐药型和敏感型PA的生物膜形成能力进行研究发现，耐药型PA的生物膜形成能力较敏感型PA更强[33]，说明生物膜在PA对碳青霉烯类药物耐药中具有一定作用。Rossi Gonçalves等采用定量检测总生物量的方式对5株MBL阳性PA菌株(2株SPM-1阳性，1株VIM阳性，2株MBL表型阳性)的生物膜形成能力进行研究，结果显示所有菌株具有强生物膜形成能力[34]，进一步显示生物膜在PA对碳青霉烯类抗生素耐药中发挥一定作用。

PA生物膜形成的调节是多方面的，主要依赖于群体感应系统、细菌双组份调节系统(two-component regulatory systems, TCS)——GacS/GacA和RetS/LadS、胞外多糖及c-di-GMP信号通路[35]。细菌通过特定信号分子的浓度变化可以监测周围环境中自身或其他细菌的数量变化，当信号分子达到一定的浓度阈值时，能启动菌体中相关基因的表达来适应环境中的变化，这种依赖细胞密度的细胞信息交流现象被称为细菌群体效应(quorum-sensing, QS)。通过对细菌QS系统的研究发现，QS参与多种细菌生物学功能的调控，控制着病原菌的致病性(如胞外酶的产生、毒力因子的表达等)和某些细菌生物膜的形成。PA含有3种主要的QS系统，分别是LasI-LasR、RhlI-RhlR和PQS-MvfR，均参与生物膜的形成。Davis等对PA生物膜的形成进行研究发现，当细菌QS作用受到抑制时，所形成的生物膜较薄，没有正常成熟的生物膜结构，并对生物灭菌剂十二烷基磺酸钠(SDS)的抵抗力显著下降；但在培养基中加入QS所需要的信号分子后，PA就能形成正常的生物膜[36]。通过QS信号系统可以控制并协调整个细菌群体行为，共同对周围环境刺激做出反应，极大增强了整个细菌群体的生存能力。

研究发现，GacA缺失PA菌株对生物膜形成能力的作用较野生型下降10倍左右，表明GacS/GacA系统在生物膜形成中具有正向调节作用[37]。相反的，RetS/LadS系统中的传感激酶RetS则抑制PA生物膜的形成[38]。PA产生的胞外多糖包含藻酸盐、Pel和Psl，起稳定生物膜结构的功能。另外，细菌裂解后释放出的eDNA作为生物膜基质的另一重要成分可促进菌体在表面进行黏附、聚集[39]。c-di-GMP是一种胞内小分子，在细菌信号传导中发挥第二信使的作用，c-di-GMP高表达与生物膜形成相关。另外，c-di-GMP还可通过调节细菌黏附作用及胞外多糖的产生，参与PA生物膜的形成[40]。细菌群体效应及c-di-GMP信号通路在PA生物膜形成过程中发挥重要调节作用，通过靶向抑制这些通路中的致病因子可作为研发抗生物膜形成药物的有效途径。

5 小结

PA作为一种条件致病菌严重威胁着人类健康，CRPA的出现给临床治疗带来极大的困难和挑战。外膜通透性降低、外排泵高表达、抗生素灭活酶的产生及生物膜的形成在PA耐药形成过程中发挥重要作用。CRPA的形成并不仅仅是由单一的机制介导，也是不同耐药机制共同作用的结果。因此，了解PA耐药机制对于临床合理使用抗生素，加强医院对PA的监测，防止多重耐药菌株水平传播，控制耐药菌株的出现具有重要意义。