王宇清，刘国辉，刘长安，康强军，王凌云，任维娜，巩进平

在现代战争条件下，由于高能爆炸性武器的应用和火器伤本身复杂性的原因，战创伤性的骨缺损发生率较高，且治疗非常困难。如何高效地修复并重建此类损伤所导致的骨缺损、骨不连甚至骨坏死已成为目前骨科研究的重点课题[1-2]。虽然应用自体骨移植修复骨缺损是目前临床最可靠的治疗方法，但是自体骨移植的并发症严重限制了其临床应用[3]。因此，应用组织工程学原理构建各种骨移植替代材料成为目前骨缺损治疗的趋势[4-5]。然而，越来越多的研究者发现，由于骨组织工程材料体积较大或血管化慢的原因，损伤后骨缺损及周围组织早期的低氧环境无法改善，从而导致修复效果变差[6-8]。而且，低氧环境会严重阻碍骨的再生，不利于支架内种子细胞的存活，从而在很大程度上限制了材料修复骨缺损效能的发挥。因此构建一种能够释放氧气于骨缺损部位的富氧骨移植替代材料，改善材料移植后早期的低氧环境是促进骨缺损修复的新希望。1-溴十七氟辛烷作为一种全氟碳化合物，其具有良好的储氧和释氧能力，在血液组织工程领域已被用于临床试验[9]。然而，将其应用于骨组织工程学研究尚未见报道。另外，学者们发现将壳聚糖(CS)、β-甘油磷酸钠(β-GP)和羟乙基纤维素(HEC)按照一定的比例混合，可以构建一种在体温(37℃)条件下凝固的水凝胶[10]，其无毒无害，具有可降解性、生物相容性、缓释性等多种优点，在骨组织工程领域已被广泛应用[11-12]。本实验首次构建了不同1-溴十七氟辛烷浓度的富氧温控型骨组织工程材料，并检测和比较其一般理化特性和释氧能力等，对表现较好的一组进行扫描电镜、细胞毒性、组织相容性等检测。现报告如下。

1 材料与方法

1.1主要实验试剂与仪器 1-溴十七氟辛烷(美国Sigma公司)；高脱乙酰度CS(美国Sigma公司)；β-GP(美国Sigma公司)；HEC(中国阿拉丁)；蛋黄卵磷脂(中国索莱宝)；超声乳化仪(美国Sonics公司)；高压氧舱(白求恩国际和平医院)；恒温水浴槽(中国成都仪器厂)；电子pH检测仪(中国上海仪电公司PHS-3C型)；CG 8+型血气分析系统(美国雅培公司)；扫描电子显微镜(美国FEI公司)；分光光度仪(中国雷杜生命科技)；光学电子显微镜及图像采集系统(日本尼康ECLIPSE100型)。

1.3实验方法

1.3.1不同1-溴十七氟辛烷浓度的富氧温控型骨组织工程材料的制备

1.3.1.11-溴十七氟辛烷浓度为5%的富氧温控型骨组织工程材料：A液配置方法为CS粉剂0.75 g溶于25 ml浓度为0.1 mol/L的盐酸溶液中，与β-GP粉剂1.725 g溶于去离子水10 ml混合，充分搅拌直至混合液透明，4℃冰箱中静置过夜充分溶解后，先后用1.2 μm和0.22 μm的超滤膜加压过滤除菌，密封后4℃保存备用。B液的配置：按照我们以往经验，蛋黄卵磷脂95 mg加入Tyrode盐缓冲液850 μl中，用超声乳化仪乳化2次，每次1 min，得到辅助乳化液备用。将1-溴十七氟辛烷原液150 μl与上述辅助乳化液混合后，用超声乳化仪乳化10次,每次1 min，得到1 ml 15%的1-溴十七氟辛烷乳液，用0.8 μm的超滤膜加压过滤除菌后，高压氧舱内充分充氧，密封后4℃保存备用。C液的配置：HEC粉末0.375 g溶于去离子水10 ml中，在室温环境下，充分搅拌溶解后，用0.22 μm的超滤膜加压过滤除菌，密封后4℃保存备用。最后，将上述A、B、C三种液体，按照4∶2.5∶1的体积比例，在无菌台上充分混合后，制备得到1-溴十七氟辛烷浓度为5%的富氧温控型骨组织工程材料原液，密封后4℃保存备用。

1.3.1.21-溴十七氟辛烷浓度为10%的富氧温控型骨组织工程材料：按照上述方法分别配置A和C两种基础溶液，通过改变上述B液配方中1-溴十七氟辛烷原液的比例，得到1 ml 30%的1-溴十七氟辛烷乳液(B1液)，用0.8 μm的超滤膜加压过滤除菌后，高压氧舱内充分充氧，密封后4℃保存备用。最后，将上述A、B1、C三种液体，按照4∶2.5∶1的体积比例，在无菌台上充分混合后，制备得到1-溴十七氟辛烷浓度为10%的富氧温控型骨组织工程材料原液，密封后4℃保存备用。

1.3.2体温下凝固时间的测定：将5%和10%浓度的1-溴十七氟辛烷富氧温控型骨组织工程材料原液置于冻存管内(n=10)，于37℃环境下进行倒置。完全凝固的标准为：将材料放入37℃环境下开始计时，30 s观察1次，观察方式为将冻存管90°倒置，以30 s内凝固的胶冻肉眼下无变形为完全凝固，该时间标记为凝固时间。该实验重复5次，取均值记录2种浓度材料的凝固时间。

1.3.3pH值测定:在室温下(约25℃左右)，用电子pH检测仪测量5%和10%浓度的1-溴十七氟辛烷富氧温控型骨组织工程材料原液的pH值，每组测量5个样本，每个样本重复测量5次，取均值记录2种浓度材料原液的pH值。

1.3.4释氧曲线的测定:在37℃环境下，制备2种不同1-溴十七氟辛烷浓度的富氧温控型骨组织工程材料于冻存管内(n=5)，每支试管内材料体积均为1 cm×1 cm×1 cm，然后往各个试管内加入10 ml的Tyrode盐缓冲液，试管密封后，置于37℃恒温水浴槽内，放置10 d，每天同一时间点内于各个试管内提取少量浸提液用CG 8+型血气分析系统检测氧分压，取均值记录并绘制释氧曲线。

1.3.5扫描电镜观察：选取较优释氧性能的富氧温控型骨组织工程材料，经过多聚甲醛固定、冲洗、抽真空脱水冻干后，修裁出样本的横截面，喷金镀膜后(厚度为10 nm)用Quanta250型扫描电子显微镜观察其截面的超微结构。

这些看似简单的小动作，可以让孕妈妈们从怀孕早期就开始锻炼身体各个部位的力量，加快体内新陈代谢的速度，提高骨盆关节和腰部肌肉的柔软性，为分娩做准备。韵律操每天都坚持做才会有良好的效果。做操时动作要轻而柔和，每次10～20分钟，做操之前应排尽大小便。

1.3.6细胞毒性试验[13]：选取较优释氧性能的富氧温控型骨组织工程材料1 cm×1 cm×1 cm，无菌条件下用10 ml的Tyrode盐缓冲液密封后浸泡10 d，用于制备材料浸提液。将8 ml的材料浸提液与0.2 ml稀释后的抗凝兔血相混合，37℃恒温培养箱内孵育1 h，高速离心后，吸取上清液用于吸光度OD值的检测，以检测材料是否对血液细胞具有毒性(n=5)。为了方便对照，我们用8 ml蒸馏水和8 ml生理盐水分别制备阳性对照和阴性对照。分光光度仪测量波长均为545 nm。

1.3.7生物相容性检测：12只新西兰白兔麻醉后，右侧大腿常规备皮、消毒，切开皮肤，钝性分离大腿部位肌肉组织后，将选取的较优释氧性能的富氧温控型骨组织工程材料1 cm×1 cm×1 cm包埋于右侧大腿肌肉组织内(手术中未损伤肌纤维)。术后，各组动物归笼常规饲养，密切观察术后伤口愈合情况。分别于术后2、4、6、8周(n=3)取植入的材料及包埋处周围的肌肉组织，4%的多聚甲醛固定，石蜡包埋，常规切片后进行HE 染色，观察材料的生物相容性情况。

2 结果

2.1富氧温控型骨组织工程材料的理化性质检测结果 2种浓度的富氧温控型骨组织工程材料均可在37℃环境下，经过4.5 min凝固成胶冻样状态，具有一定的机械强度，2组凝固时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。2种浓度的富氧温控型骨组织工程材料原液pH值均值为6.7左右，接近中性，2种浓度材料的pH值比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.2释氧能力检测结果 随着时间延长，2种浓度材料浸提液中氧分压呈上升趋势，并在7 d达到峰值，10 d内均可持续释放氧气，且10%浓度组在1～10 d的各个时间点的氧分压明显高于5%浓度组(P<0.01)。因此，与5%浓度组相比，1-溴十七氟辛烷浓度为10%的材料释氧效能更高。见图3。

图1 不同1-溴十七氟辛烷浓度的富氧温控型骨组织工程材料凝固时间比较

图2 不同1-溴十七氟辛烷浓度的富氧温控型骨组织工程材料原液pH值比较

图3 不同1-溴十七氟辛烷浓度的富氧温控型骨组织工程材料的释氧曲线

与5%浓度1-溴十七氟辛烷富氧温控型骨组织工程材料比较，bP<0.01

2.3扫描电镜检测结果 对10%浓度1-溴十七氟辛烷浓度的富氧温控型骨组织工程材料进行扫描电镜观察结果显示：材料横断面为无定向结构，且较多粗细不等的纤维交织成三维立体网状(图4A)，结构内微孔孔径较为均一，直径在100～200 μm(图4B)。

2.4细胞毒性检测结果 对材料浸提液进行稀释后抗凝兔血混合实验的结果显示：材料浸提液组和生理盐水组的混合液均为无色透明，而蒸馏水组的混合液明显呈淡红色，且材料浸提液组和生理盐水组的OD值比较差异无统计学意义(P>0.05)，而蒸馏水组的OD值高于材料浸提液组(P<0.01)。见图5。

图4 10%浓度1-溴十七氟辛烷富氧温控型骨组织工程材料的超微结构

A.材料的横断面为由较多粗细不等的纤维交织成的无定向网状结构；B.结构内微孔孔径较均一，直径100～200 μm

2.5生物相容性检测结果 本实验中所有动物无死亡，伤口无感染，均符合实验要求，并纳入实验分析。对植入材料及周围肌肉组织的HE染色结果显示：术后2周，大体见：植入材料明显缩小，局部分割被包膜包裹，未见脓液及周围肌肉坏死组织；镜下见：植入材料为大片均质红染物质，材料周围可见多数多核炎性细胞浸润和成纤维细胞增生，材料内见少许多核炎症细胞浸润，周围肌纤维萎缩，未见明显溶解坏死。术后4周，大体见：植入材料进一步萎缩，部分植入物血管化较明显，触之易出血且活动度差；镜下见：均质红染物质内大量肉芽组织长入，多核炎症细胞明显减少，周围肌纤维形态正常，未见明显纤维化和坏死表现。术后6周，大体见：未见胶冻样移植物残留，部分个体遗留少量瘢痕组织，周围肌肉组织稍显肿胀；镜下见：未见均质红染物质，周围肌纤维形态正常，可见少许多核炎症细胞；术后8周，大体和镜下均见正常肌肉组织。见图6。

图5 10%浓度1-溴十七氟辛烷富氧温控型骨组织工程材料的细胞毒性检测

与材料浸提液组比较，bP<0.01

图6 10%浓度1-溴十七氟辛烷富氧温控型骨组织工程材料的生物相容性实验结果(HE)
A、B为术后2周；C、D为术后4周；E、F为术后6周；G、H为术后8周

3 讨论

骨的修复过程是一个需要大量氧气和营养物质的过程。临床上骨缺损或骨不连的发生，大多是由于损伤局部缺氧、缺血，从而发生骨梗死等原因导致的。有研究证实，高压氧可以使成骨细胞表达更多的骨形态形成蛋白(BMP-2)，刺激成骨活动，抑制破骨活动，从而促进骨的再生[14]。因此，在骨的修复过程中，损伤局部由始至终的充分氧供被研究者认为至关重要。目前，临床上应用自体骨移植修复骨缺损是治疗骨缺损的金标准，而且带血供的骨瓣移植明显优于游离自体骨移植的修复效果，可能是因为带血供的骨瓣移植早期局部的氧供状态明显优于未血管化的游离自体骨移植。然而，由于带血供的骨瓣移植要求特殊解剖学特点的局限性和自体游离骨移植的并发症限制了其临床应用。因此，应用组织工程学原理构建各种骨移植替代材料成为目前骨缺损治疗的趋势。但是，研究者们同样发现，移植局部由始至终的充分氧供同样限制了组织工程骨的应用。研究者普遍认为，随着组织工程支架的增大和移植后支架血管化较慢的原因，支架内部的早期低氧环境无法改善，往往导致支架内部种子细胞凋亡，从而使其促进成骨的能力下降。在骨组织工程学中，骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)被认为是“黄金种子细胞”，具有明显的促进成骨的效能。有研究证实，在体外实验中，厌氧环境可以明显阻碍MSCs向成骨细胞分化[15]；而有效的富氧环境可以有效地促进MSCs的存活和增殖，并下调MSCs部分低氧基因的表达，阻碍其向软骨细胞分化，促进其向成骨细胞分化，从而达到成骨效果[8]。因此，在骨组织工程支架的构建中，改善支架内部的低氧环境对于其成骨效能的最大化至关重要。

具有富氧特性的全氟碳化合物PFCs的出现为组织工程学解决早期低氧环境提供了新的解决方案。PFCs是一类具有类似结构的高分子惰性化合物，其化学性质稳定，无毒无害、亲脂、疏水，具有较好的生物相容性，在体内虽然不降解代谢，但可被吸收入血后经肺脏排出体外。更重要的是，该化合物具有良好的气体溶解度，其氧气溶解度是血液的2～3倍，作为良好的呼吸气体运载体，最早被广泛应用于人造血液、器官移植保存液等方面的研究。在骨组织工程领域，全氟碳化合物同样得到了广泛的应用。将全氟碳化合物PFTBA与MSCs水凝胶相复合用于大鼠骨缺损的治疗，PFTBA可以有效改善移植部位的低氧环境，促进MSCs的存活和分化，促进移植物血管化程度和骨再生[7]。进一步的体外机制研究表明，PFTBA不仅可促进MSCs的存活，而且可以通过调整基因表达，阻碍其向软骨细胞分化，促进其向成骨细胞分化[8]。在血液组织工程学、神经组织工程学及慢性溃疡的修复等方面，全氟碳化合物尤其是PFTBA同样被证实可以有效改善低氧环境，促进修复效果。然而，目前将PFTBA用于临床的实验研究较少见。本实验中采用的1-溴十七氟辛烷同样是一种全氟碳化合物，具有富氧剂特有的上述特性，作为第二代“人造血液”Oxygent的主要成分，已被应用于Ⅲ期临床试验[16-17]。

CS水凝胶是一种常用的组织工程材料，被广泛应用于皮肤、神经、药物缓释系统等领域[18]。在骨组织工程领域，由于水凝胶本身的机械强度较差，水凝胶往往与其他机械强度较好的骨组织工程材料相复合，通过发挥其快速降解、促进成骨、药物缓释等优点，在骨组织工程领域发挥作用[19-22]。通过对CS水凝胶制备工艺的进一步改进，研究者们制备出了CS-β-GP-HEC温控型水凝胶，该水凝胶在常温状态下呈液体状态，一旦注入体内37℃的环境下即可在短时间内凝固[23-25]。将种子细胞、细胞因子和其他药物成分与该温控型水凝胶相复合，填充于其他机械性能较好的骨移植材料当中，便于上述成分在修复材料中的均匀分布和缓释效果的发挥，从而使修复效能最大化。

在本实验中，我们将增氧剂1-溴十七氟辛烷复合入改良后的CS-β-GP-HEC水凝胶中，制备含有增氧剂1-溴十七氟辛烷的富氧温控型骨组织工程材料。通过对不同增氧剂浓度的材料进行凝固时间、pH值、释氧曲线的检测，我们认为10%浓度的增氧剂材料具有较好的理化特征和更好的释氧性能。扫描电镜结果显示：材料为无定向的网状结构，结构广泛存在的微孔结构便于种子细胞、细胞因子和药物成分的附着和分布，有利于组织间氧气、营养物质和代谢产物的交换和运输，也有利于新生血管的长入。细胞毒性及生物相容性实验显示，该材料无细胞毒性，生物相容性良好，在体内可被完全降解。因此，我们认为，将富氧剂复合入骨组织工程材料中，可以有效改善移植物早期的细胞代谢微环境，可能会进一步促进支架内功能性种子细胞和血管内皮细胞的存活和分化，从而最大化骨组织工程材料修复骨缺损效能的发挥[26]。

综上所述，本实验筛选并制备的1-溴十七氟辛烷浓度为10%的富氧温控型骨组织工程材料无毒无害，具有良好的理化特性、释氧性能、生物相容性和可降解性。这种新型富氧温控型骨组织工程材料在骨缺损治疗的研究中具有良好的应用前景。