董晓丹，穆素红

肾细胞癌占成人肾脏原发性恶性肿瘤的90%，肾细胞癌早期患者通常没有明显的临床症状，当患者确诊为肾细胞癌时通常已经发展至晚期[1-4]。因此，寻找一种疗效好、不良反应小、安全性高的治疗药物迫在眉睫。姜黄素是从中药姜黄根茎中提取的一种天然二酮类化合物，具有抗肿瘤活性，在肝癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌等实体肿瘤的细胞学研究中，被证实具有抑制肿瘤转移、肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，以及增敏抗癌药物活性[5-6]。本研究旨在研究姜黄素对体外培养的肾癌A498细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 人肾癌A498细胞(中国医学科学院细胞中心)，姜黄素(sigma公司，纯度97%，用无水乙醇溶解)，二甲基亚砜、胎牛血清(杭州四季青公司)、CCK-8细胞增殖检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)，Hoechst-PI双染试剂盒(南京建成生物研究所)，BCA蛋白测定试剂盒、PVDF膜及化学发光试剂(上海碧云天公司)，p53、p21及GAPDH抗体(上海碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养:在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养肾癌A498细胞，青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml，培养箱内温度为37℃，CO2体积分数为5%，每3天传代1次，更换新鲜培养液，取对数期生长的细胞进行实验，细胞密度达到80%左右，用胰酶消化进行实验。

1.2.2肾癌A498细胞分组：细胞接种于96孔板，分4组，每组5个复孔。对照组以正常培养液培养24 h。姜黄素组依姜黄素浓度不同分为10、20、40 μmol/L组，培养48 h后进行后续实验。

1.2.3CCK-8法检测细胞增殖情况:肾癌A498细胞接种于96孔板中，每孔200 μl细胞密度为1×105/ml，弃去原有培养液，将已配置含10% CCK-8的培养基以换液的形式加入，接种后的96孔板37℃培养箱中培养4 h，观察细胞已贴壁。检测480 nm吸光度。

1.2.4细胞凋亡的形态学观察:我们采用Hoechst-PI染色法定量观察细胞凋亡情况，细胞接种于6孔板中，调整细胞密度至3×105/ml，按照试剂盒说明，更换细胞培养液并用PBS冲洗3遍，在150 μl的Binding Buffer中分别加入Hoechst(5 μl)及PI(2 μl)混匀，室温避光反应5 min，荧光显微镜下观察、拍照并统计分析凋亡细胞比例。

1.2.5细胞超微结构变化：室温下1%锇酸固定细胞2 h，丙酮脱水，常规电镜包埋，制作超薄切片，枸橼酸铅和2%醋酸双氧铀染色，透射电镜观察。

1.2.6蛋白免疫印迹试验检测肾癌A498细胞内p53及p21蛋白表达：提取蛋白质后以Brandford法测定每个样品蛋白浓度。加入上样缓冲液，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后5%脱脂奶粉4℃封闭2 h，加一抗(稀释浓度1∶1000)过夜，室温下孵育二抗(稀释浓度1∶2000)1 h，ECL化学发光法自显影并采集图像，利用样本目的蛋白光密度比内参条带光密度，比较不同样本相对表达率。

2 结果

2.1细胞增殖情况 随姜黄素作用浓度增加，肾癌A498细胞增殖率逐渐降低，10、20及40 μmol/L姜黄素作用于肾癌A498细胞48 h后，细胞增殖率分别为(72.00±3.61)%、(57.43±3.61)%和(34.67±3.61)%，对照组为(95.33±53.44)%。姜黄素10、20及40 μmol/L组肾癌A498细胞增殖率低于对照组，且姜黄素不同浓度组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 MTT法检测姜黄素对肾癌A498细胞增殖率的影响

10、20、40 μmol/L组分别给予不同浓度姜黄素处理；与对照组比较，bP<0.01；与10 μmol/L组比较，dP<0.01；与20 μmol/L组比较，fP<0.01

2.2姜黄素对肾癌A498细胞凋亡的影响 荧光显微镜下，对照组背景荧光暗黑色，可见数个散在凋亡细胞核(亮蓝色强荧光)，细胞凋亡率为(2.33±1.87)%；10、20及40 μmol/L姜黄素作用于肾癌A498细胞后凋亡细胞数量增多，甚至出现红染的坏死细胞，细胞凋亡率分别为(19.00±3.74)%、(34.67±3.38)%、(75.67±5.44)%，均高于对照组，且姜黄素不同浓度组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图2、3。

2.3姜黄素对肾癌A498细胞超微结构变化的影响 对照组细胞形态规则，核仁类圆形，染色质正常，胞质内粗面内质网结构正常，线粒体峭可见。10 μmol/L姜黄素作用肾癌A498细胞48 h后，细胞膜边缘部分膨出，细胞核内染色边集，伴随姜黄素作用浓度增加，部分细胞内可见凋亡小体，细胞核染色质浓缩，粗面内质网及线粒体形态不清晰。见图4。

图2 4组肾癌A498细胞凋亡情况(×200)
10、20、40 μmol/L组分别给予不同浓度姜黄素处理

图3 姜黄素对肾癌A498细胞凋亡的影响

10、20、40 μmol/L组分别给予不同浓度姜黄素处理；与对照组比较，bP<0.01；与10 μmol/L组比较，dP<0.01；与20 μmol/L组比较，fP<0.01

2.4姜黄素对p53及p21蛋白表达影响 10、20及40 μmol/L姜黄素作用于肾癌A498细胞48 h后，p53蛋白相对表达量分别为(40.29±2.09)%、(99.46±6.73)%、(133.43±13.50)%，对照组为(32.53±1.87)%。姜黄素10、20及40 μmol/L组p53蛋白相对表达量较对照组升高，且不同浓度姜黄素组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。10、20及40 μmol/L姜黄素作用于肾癌A498细胞48 h后，p21蛋白相对表达量分别为(49.77±3.70)%、(95.93±6.13)%、(133.10±7.92)%，对照组为(23.12±4.52)%)。姜黄素10、20及40 μmol/L组p21蛋白相对表达量较对照组升高，且不同浓度姜黄素组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图5、6。

图4 姜黄素对肾癌A498细胞超微结构变化的影响(×5000)
10、20、40 μmol/L组分别给予不同浓度姜黄素处理

图5 4组肾癌A498细胞内p53及p21蛋白表达情况
10、20、40 μmol/L组分别给予不同浓度姜黄素处理

图6 姜黄素对肾癌A498细胞内p53及p21蛋白表达影响

10、20、40 μmol/L组分别给予不同浓度姜黄素处理；与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与10 μmol/L组比较，cP<0.05，dP<0.01；与20 μmol/L组比较，eP<0.05，fP<0.01

3 讨论

肾细胞癌首选手术治疗，但由于恶性肿瘤具有侵袭性生长，增殖较快，与周围正常组织间无明显界限的特点，手术过程中难以彻底切除，因此，化疗及靶向治疗在肾细胞癌治疗中逐渐发挥重要作用[7-9]。治疗肾细胞癌化疗药物种类较多，其在促进肿瘤细胞凋亡的同时，也抑制了人体正常细胞的生长代谢，使免疫系统遭到破坏[10-11]。化疗药物均有不同程度的毒副作用，因此，选择一种低毒、安全的化疗药物对肾细胞癌患者预后至关重要[12-13]。

姜黄素是广泛存在于多种中草药中的二酮类化合物，对多种人肿瘤细胞有不同程度抑制作用，姜黄素通过增加线粒体膜通透性、促进肿瘤细胞凋亡发挥抗癌作用，对鼻咽癌细胞系、乳腺癌细胞系、急性髓性白血病细胞系和肝癌细胞系均有抑制作用[14-17]。姜黄素具有低毒、价格低廉的特点，具有广阔的研究和应用前景[18-20]。近年来，有学者将姜黄素应用于人肾癌Caki-2细胞，显示了姜黄素通过抑制H-Ras蛋白表达、直接或间接下调ERK信号通路蛋白表达，从而诱导Caki-2细胞凋亡[21]。

CCK-8法主要用于细胞毒性及细胞增殖率的检测。本研究结果显示，姜黄素对人肾癌A498细胞生长具有抑制作用，肾癌细胞增殖率随姜黄素浓度的增加而降低，呈一定的剂量依赖性。为了验证姜黄素对肾癌细胞A498凋亡的促进作用，我们采用Hoechst PI核染色法观察细胞凋亡情况，正常细胞核的Hoechst着色呈淡蓝色，凋亡早期及中期细胞核由于核染色质浓集呈亮蓝色，可见核边集或碎片，处于凋亡晚期或坏死期的细胞核可被PI染料着色，荧光显微镜下呈红色。本研究结果显示，姜黄素干预肾癌A498细胞后，凋亡及坏死细胞明显增多，证实姜黄素可以剂量依赖性促进肾癌A498细胞凋亡。

研究指出，姜黄素可以激活凋亡前体蛋白p53和其下游效应物p21抑制乳腺癌细胞系MCF-7细胞的增殖[22]。为了进一步明确姜黄素抑制肾癌A498细胞活性的具体机制，我们检测了细胞内凋亡前体蛋白p53和其下游效应物p21的蛋白表达情况。蛋白免疫印迹结果显示，姜黄素能激活p53表达，上调p21蛋白表达水平。

综上所述，本研究结果为临床应用姜黄素治疗肾癌提供了理论及实验依据，但治疗效果以及药物治疗浓度仍待大规模临床试验进一步证明。