彭鹏 程然 赵逸超 祝朝前

(唐山市工人医院肝胆外一科，河北 唐山 063000)

肝细胞性肝癌(HCC)是目前最为常见的恶性肿瘤，是全球范围内第三大癌症相关性致死性疾病〔1〕。早期HCC的治疗一般采取外科手术切除、射频消融、动脉化疗栓塞以及常规方案化疗。然而由于HCC早期阶段的无症状性，HCC患者表现出临床症状往往错过了最佳的治疗阶段。目前，对于HCC多采用综合治疗方案，其中抗肿瘤药物的应用仍然是延缓HCC疾病发展，提高患者生存质量的常规方案。但是，对于中晚期HCC患者的治疗仍表现为转移风险高、预后效果差的特点，5年生存率不足5%〔2〕，因此临床上亟待开发HCC新型治疗型药物。研究显示，通关藤(GFR)作为天然活性药物，具有广泛的药理学活性，主要表现为抗肿瘤、平喘、降压、免疫抑制及保肝利尿作用〔3〕。但对于其抗肿瘤作用机制的研究尚不明确，特别是对于HCC的抗肿瘤活性仍需要深入研究和探讨。本试验主要研究通关藤对于人肝癌细胞HepG2增殖和侵袭的影响，并进一步讨论其对于血管内皮生长因子(VEGF)-D相关肿瘤细胞增殖和侵袭的潜在调节作用。

1 材料与方法

1.1材料 人肝癌细胞株HepG2(唐山市工人医院科研中心提供)；GFR制剂(20 ml/支，批号：201806121，南京圣和药业，商品名：消癌平，每1 ml相当于1 g原药材)；细胞培养液DMEM(GIBCO公司,美国)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；RIPA蛋白裂解液(江苏碧云天公司)；MTT(Sigma公司)；抗体VEGF-D(Santa Cruz公司)；抗体β-Actin(Cell Signal公司)。

1.2试验方法

1.2.1人肝癌细胞株HepG2培养 取人肝癌细胞株HepG2在含有10%DMEM培养基中(100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)，37℃、5%CO2饱和湿度体外培养，每24 h半量更换培养基，应用0.25%胰酶消化传代培养，用于试验干预处理。

1.2.2通关藤制剂药物处理HepG2细胞 取人肝癌细胞株HepG2在含有10%DMEM培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度体外培养，24 h半量换液后，接种于96孔板或6孔板，随机分为溶剂对照组、药物干预组(10 mg/ml组、20 mg/ml组、40 mg/ml组)。

1.2.3噻唑蓝(MTT)法检测HepG2细胞增殖率 取正常培养人肝癌细胞株HepG2细胞接种于96孔板，各组分别给予不同处理，溶剂对照组给于等体积培养基，药物干预组分别给于GFR终浓度10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml处理，培养24 h后，每孔加入20 μl MTT液(3.6 mmol/L)，37℃孵育4 h，弃上清，加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻振荡溶解甲臜结晶，酶标仪测定570 nm波长处的吸光度值，每组设定5个复孔，以对照组吸收度的均值为100%，细胞的存活率=(各样本吸收度值-空白组吸光度值)/(对照组吸收度-空白组吸光度值)×100%。

1.2.4划痕法检测HepG2细胞侵袭率 取试验细胞制备HepG2单细胞悬液，每孔1×106接种于6孔板，37℃、5%CO2条件全营养培养，待贴壁完全，设置溶剂对照组，药物干预组(20 mg/ml)。利用tip枪头用力均匀在培养皿中划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。37℃、5%CO2条件继续培养，每24 h测量一次细胞迁移距离，进而评价GFR针对肝癌细胞株HepG2细胞侵袭的影响。侵袭率=(划痕面积0 h-划痕面积24 h)/划痕面积0 h。

1.2.5Western印迹法检测VEGF-D表达水平 取正常培养人肝癌细胞株HepG2细胞接种于6孔板，设置溶剂对照组，药物干预组(20 mg/ml)。RIPA裂解细胞，离心取上清，提取总蛋白。提取蛋白10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)分离蛋白，聚偏氟乙烯(PVDF)4℃转膜2 h，5% TTBS(Tris-HCl缓冲液，0.1% Tween-20)室温封闭2 h，VEGF-D抗体4℃孵育过夜，TBS-T(10 mmol/L Tris-HCl缓冲液,150 mmol/L NaCl,0.05% Tween-20)，二抗室温孵育2 h，电化学发光(ECL)法处理，Image J图像分析软件对条带进行定量分析。

1.3统计学分析 采用SPSS15.0进行t检验。

2 结 果

2.1GFR对于人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响 相比溶剂对照组〔(100±0.00)%〕，10、20、40 mg/ml GFR干预HepG2细胞24 h，细胞活力分别为(97.2±3.2)%、(87.3±4.7)%、(84.8±7.4)%，随着药物浓度的增大，OD值均逐渐减少，抑制HepG2细胞增殖率显著增大。20 mg/ml组干预24 h开始抑制溶剂HepG2细胞增殖，相比溶剂对照组，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。这说明GFR对于HepG2细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖关系。

2.2GFR对于人肝癌细胞株HepG2细胞侵袭的影响 相比溶剂对照组〔(88.7±2.8)%〕，GFR 20 mg/ml组〔(54.5±2.4)%〕能够显著性抑制HepG2细胞侵袭。见图1。

2.3Western印迹法检测VEGF-D在人肝癌细胞株HepG2细胞的表达 给予GFR干预处理24 h后，相比溶剂对照组细胞，VEGF-D表达显著降低(P<0.05)。见表1、图2。

表1 GFR对人肝癌细胞株HepG2细胞VEGF-D表达的影响

与溶剂对照组比较：1)P<0.05

1～4：溶剂对照12 h，GFR 12 h，溶剂对照24 h，GFR 24 h图2 GFR对于人肝癌细胞株HepG2细胞VEGF-D表达的影响

3 讨 论

肿瘤增殖和侵袭是一个多因素的发展过程，涉及原发病灶的形成，细胞脱落，血管生成等多个环节。其中抑制肿瘤血管的生成已经成为近年来抗肿瘤研究的热点领域，特别是针对HCC肿瘤发展起重要调控作用。相关研究报道，VEGF-D参与并促进了转移灶的形成〔4〕。有研究显示，VEGF-D在肝内皮细胞增殖和侵袭方面起重要调节作用，还与淋巴管的新生和发展联系紧密〔5〕。研究显示，VEGF-D是激活肿瘤血管生成的重要信号通路，还是转移灶形成过程中的重要步骤及肿瘤转移后发展的重要调节因子〔6,7〕。因此探索调控VEGF-D的有效途径对于开发HCC治疗型药物意义重大。

GFR为萝藦科牛奶菜属植物，主要分布在中国贵州、云南、福建等地，在当地民间癌症治疗上有不错效果。研究发现，通关藤具有免疫调节、保肝利尿、败毒抗癌等功效〔3〕。有文献报道，GFR对于胃癌〔8〕、食管癌〔9〕、肠癌〔10〕等表现出明显的抑制增殖作用，但是尚未阐明GFR的抗肿瘤机制。本研究主要是讨论GFR对于人肝癌HepG2细胞功能的影响，主要从细胞增殖和侵袭两个方面开展研究，并深入讨论其调控机制。本试验研究结果显示，GFR对于人肝癌细胞株HepG2细胞增殖具有显著的抑制作用。表明GFR作为天然抗肿瘤活性药物，对于人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖关系。GFR处理24 h能够明显抑制HepG2细胞侵袭。表明，通关藤在调控HepG2细胞增殖和侵袭方面均表现出明显的抑制作用。GFR显著性的抑制HepG2细胞VEGF-D的表达，随着干预时间延长，VEGF-D的表达逐渐降低，当给药时间到达24 h，VEGF-D的表达水平相比对照组出现显著性降低。

综上所述，VEGF-D参与肿瘤血管生成和转移灶的形成，HCC肿瘤细胞HepG2过表达VEGF-D，这种由VEGF-D所介导的HepG2细胞增殖和侵袭能够被GFR所逆转。结合本研究试验结果，GFR抑制HepG2细胞增殖和侵袭的同时伴随着VEGF-D表达的显著降低。本试验结果为HCC抗肿瘤治疗提供潜在的治疗可能，特别是针对高转移风险高、不良预后效果的HCC肿瘤的治疗提供重要理论依据。