张利芳 王云华 郝艳梅 何珊

(1包头医学院医学技术学院，内蒙古 包头 014040；2包头市肿瘤医院检验科；3包头医学院第一附属医院检验科)

硒蛋白(Sel)S是近年来新发现的一种跨膜蛋白，定位于内质网膜，具有调节氧化应激、内质网应激、炎症和免疫等重要功能。SelS在多种疾病的发生发展中起作用，如心血管疾病、2型糖尿病、炎症、阿尔茨海默病等。流行病学研究发现SelS基因的多种单核苷酸多态性与心血管疾病、肿瘤等密切相关〔1,2〕。本课题拟探讨食管癌患者SelS基因遗传易感性与相关危险因素的关联性。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2016年12月至2017年6月在包头市肿瘤医院、包头医学院第一附属医院经临床组织病理学确诊的新发汉族食管癌患者124例为病例组，其中男100例，女24例，平均年龄(65.17±0.79)岁。收集同期社区健康对照者132例为对照组，其中男105例，女27例，平均年龄(65.21±0.83)岁，经问卷调查排除冠心病、高血压、糖尿病、其他恶性肿瘤和消化系统疾病患者。同时记录两组吸烟、饮酒情况(吸烟准入标准：每天1支以上，时间超过6个月；饮酒标准：平均每周1次，时间超过1年)。病例组和对照组年龄和性别匹配(年龄：t=0.621，P=0.975；性别：χ2=0.048，P=0.876)。

1.2实验试剂、仪器 血液基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR Master Mix、50 bp DNA Marker(北京天根公司)，聚合酶链反应(PCR)仪(美国Veriti，96 Well)。

1.3基因组DNA提取与引物合成 采集研究对象空腹乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血2 ml提取血液基因组DNA。通过Pubmed-SNP数据库查询SelS基因G-254A(rs34713741)两侧基因序列，应用软件Primer premier5.0设计引物(表1)。

表1 SelS基因rs34713741位点引物设计

特异性内引物F1和R1分别在3′端倒数第3位引入1个人为的错配碱基(划线部分)以便于增加分型的特异性。F1和R2组合检测T等位基因，其PCR产物大小为122 bp。F2和R1组合检测C等位基因，其PCR产物大小为221 bp。外引物F2和R2组合扩增出的PCR片段大小为302 bp，作为阳性对照。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4四引物扩增阻碍突变体系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)扩增 反应体系为25 μl，包括：DNA模板6 μl(约100 ng)，F2和R2(10 μmol/L)各0.4 μl，F1和R1(10 μmol/L)各0.8 μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl，去离子水4.1 μl。PCR条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循环35次，最后72℃延伸5 min。PCR产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。随机选取50个PCR产物送上海生工生物技术公司进行测序验证，所用引物为表1中的F2和R2，PCR体系为50 μl，包括：DNA模板12 μl(约100 ng)，F2和R2(10 μmol/L)各2 μl，2×Taq PCR Master Mix 25 μl，去离子水9 μl。反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循环35次，最后72℃延伸5 min。

1.5统计学分析 采用SPSS20.0软件进行Hardy-Weinberg平衡检验、χ2检验，非条件Logistic回归分析计算风险比(OR)及其95%可信区间(CI)。

2 结 果

2.1Tetra-primer ARMS-PCR基因分型结果 PCR后可见3种基因型：302 bp、221 bp和122 bp 3条带为CT型，302 bp、122 bp两条带为CC型，302 bp、221 bp两条带为TT型，见图1。

2.2SelS基因G-254A位点基因测序结果 SelS基因G-254A位点3种基因型测序结果与Tetra-primer ARMS-PCR结果一致，见图2。

1，3，7：TT型；2：CT型；4～6：CC型；M：50 bp Marker图1 SelS基因G-254A位点基因分型

A：CC型；B：TC型；C：TT型；横线部分为限制性内切酶识别序列，箭头所指为SelS基因G-254A位点碱基图2 SelS基因G-254A位点基因测序结果

2.3SelS基因G-254A位点基因型和等位基因频率分布 病例组与对照组CC、CT、TT基因型分布有统计学差异(P=0.002，OR=2.029，95%CI：1.361～3.025)；等位基因C、T分布有统计学差异(P=0.000，OR=2.005，95%CI：1.363～2.951)，见表2。

2.4两组吸烟人群SelS基因G-254A位点基因型和等位基因分布 两组吸烟人群CC、CT和TT基因型分布频率比较有统计学差异(P=0.005，OR=2.898，95%CI：1.478～5.685)；等位基因C、T分布有统计学差异(P=0.002，OR=2.611，95%CI：1.410～4.835)，说明吸烟与SelS基因G-254A位点基因突变交互作用增加食管癌患病风险，见表3。

2.5两组饮酒人群SelS基因G-254A位点基因型和等位基因分布 两组饮酒人群CC、CT、TT基因型分布比较无统计学差异(P=0.086，OR=2.052，95%CI：1.704～3.918)；等位基因C、T分布比较无统计学差异(P=0.051，OR=1.746，95%CI：0.994～3.068)，说明饮酒与SelS基因G-254A位点基因多态性无相关性，见表4。

2.6食管癌危险因素多因素Logistic回归分析 吸烟、饮酒和基因突变是食管癌发病的风险因素(均P<0.1)，见表5。

表2 SelS基因G-254A位点基因型、等位基因分布〔n(%)〕

表3 两组吸烟人群 SelS基因G-254A位点基因型、等位基因分布〔n(%)〕

表4 两组饮酒人群 SelS基因G-254A位点基因型、等位基因分布〔n(%)〕

表5 食管癌危险因素多因素Logistic回归分析

3 讨 论

相关体外细胞实验表明SelS细胞质区域具有硫氧还原蛋白(Trx)依赖的还原酶活性调节细胞氧化还原平衡，有效降低细胞内高活性分子如活性氧簇(ROS)的水平，从而保护细胞免受氧化损伤；并且在内质网中，SelS与p97三磷酸腺苷(ATP)酶(也称为VCP)、Derlin伴侣蛋白、E3泛素连接酶和SelK共同组成内质网相关蛋白降解过程复合体，促进未(或错误)折叠蛋白从内质网腔逆向转运至细胞质被降解，从而有效减弱内质网应激〔1〕。此外，体外和体内细胞实验均揭示SelS基因启动子区域中有两个与核转录因子(NF)-κB结合的位点，参与调节血浆中炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1、 IL-6等的表达〔1，3〕。SelS是人体内非常重要的蛋白，不仅参与调节氧化应激、内质网应激、炎症等，还参与细胞免疫、甲状腺激素代谢等。缺硒或硒中毒与多种疾病的发生有关，如心血管疾病、糖尿病、肿瘤、免疫和甲状腺功能低下等〔1～6〕。最近研究发现还具有很强的抗肿瘤效应，其基因变异将会影响功能的发挥，继而导致机体抵抗致癌物的功能降低〔7〕。

目前，关于SelS基因多态性与相关疾病易感性的关联研究主要包括15个多态性位点，但主要集中在G-105A(rs28665122)和G-254A(rs34713741)两个位点。SelS基因多态性被认为与消化道肿瘤的发病密切相关〔7〕。Sutherland等〔8〕对结肠直肠癌患者SelS基因的G-254A多态性进行检测，结果显示G-254A多态性位点与结肠直肠癌的发病风险有相关性，T等位基因为风险等位基因。毛华杰等〔9〕检测胃癌患者SelS基因G-105A和G-254A位点多态性，发现携带T等位基因的个体患胃癌的风险是CC基因型个体的1.89倍(OR=1.89，95%CI：1.10～3.23)。张龙等〔10〕研究发现SelS基因(rs34713741位点)CT基因型相比于CC型患结直肠癌的风险升高(OR=1.597，95%CI：1.096～2.326)。邢少姬等〔11,12〕发现携带T等位基因的个体患胃癌、肝癌的风险增加。本研究提示吸烟人群罹患食管癌的风险是不吸烟人群的1.782倍，饮酒人群风险是正常人的1.594倍，SelS基因多态性是食管癌的遗传易感因素。这也说明了食管癌是遗传与环境因素共同作用的结果。

本研究说明SelS基因G-254A位点多态性与内蒙古汉族人群食管癌的发病风险存在相关性，T等位基因可能是该人群食管癌发病的危险因素之一。据研究吸烟人群比不吸烟者更多地发生 p53 突变，大量吸烟与食管鳞癌患者中 p53 突变呈正相关，吸烟频率和持续时间增加了p53 基因突变的风险性〔13〕。本研究结果提示吸烟与基因突变交互作用可提高食管癌患病风险，从而进一步证明了遗传与环境的交互作用对食管癌的影响。