丁一 赵伟峰 李波 周焯家 郭涛 简月奎

(贵州省人民医院骨科，贵州 贵阳 550002)

脊柱骨质疏松是较为常见的骨质疏松类型，早期治疗手段主要包括药物治疗及支具佩戴治疗，但药物治疗见效慢，在发病期间快速提高患者骨强度的难度较大，患者仍有较高的骨折坍塌风险，故找到一种能够快速改善患者骨密度、增强脊柱椎体检融合、减少坍塌发生的治疗方法尤为关键且迫切〔1,2〕。随着纳米骨浆这种新骨组织功能及材料的出现，为脊柱骨质疏松性压缩骨折的治疗带来新的突破〔3〕。纳米骨浆是一种能体现出高度仿生特性的材料，结晶羟基磷灰石、磷酸钙是其主要成分，可代替骨组织，有着极高的生物相容性与吸收性〔4,5〕。研究表明，将BMP-2真核质粒与纳米骨浆融合后，形成的基因释放系统成骨效能更佳，骨质量高〔6,7〕。但目前国内外并未将该系统作为常用材料用于脊柱骨质疏松性压缩骨折治疗，且相关研究也较少见。本研究旨在观察BMP-2基因活化纳米骨浆促脊柱椎体间融合的价值，以期为未来BMP-2基因活化纳米骨浆的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 2018年1月，取20只雌性山羊，年龄5～7〔平均(6.41±0.25)〕岁；体重35～45 kg，平均(39.45±2.14)kg。

1.2纳米骨浆 由Cem Ostetic TM，Berkeley Advanced Biomaterials公司提供。

1.3pIRES-hBMP-2/真核表达载体 由华中科技大学分子生物实验室构建，制备质粒后提取定量，经无菌蒸馏水稀释保存。

1.4血液生化指标 取山羊血，经处理后取血清放至有促凝剂的生化采血管内，检测骨钙素、碱性磷酸酶表达。

1.5Micro CT扫描 山羊椎体离解至单个，去除周围组织、肌肉等成分，经环钻钻取椎体松质骨，扫描分析皮质骨，制作环形皮质骨，21 μm分辨率，5个样本为1组扫描，后重建分析。

1.6生物力学 对椎体与股骨髁松质骨经轴向加压测量其力学强度，测量时在加压磨具内置入圆锥形椎体骨块，施加压力逐渐将其压缩至椎体长度50%。

1.7模型构建与观察指标

1.7.1构建成效 观察BMP-2基因活化纳米骨浆构建情况，看其是否符合本次实验的要求。

1.7.2椎体最大载荷 随机抽取15具椎体，Micro CT扫描测定60个椎体的骨密度，保证其在椎体骨密度一致的条件下，将其随机分为3组，包括空白对照组(n=30)、纳米骨浆组(n=15)、BMP-2基因活化纳米骨浆组(n=15)。在C型臂X线机引导下，分别经双侧椎弓根为纳米骨浆组与BMP-2基因活化纳米骨浆组填充纳米骨浆及BMP-2基因活化纳米骨浆，后压缩全部椎体高度为原始高度50%，对比3组模型脊柱椎骨最大压缩应力与最大载荷。

1.7.3血液生化指标 将20只雌性山羊使用Micro CT扫描，确认其山羊骨密度一致后，随机分为正常组(n=5)、假手术组(n=5，开腹后便将切口缝合)、双侧卵巢切除术组(n=10，将山羊双侧卵巢切除)。分别于术前、术后6个月检测山羊血清内骨钙素与碱性磷酸酶表达。术后6个月检测双侧卵巢切除组骨密度及骨小梁结构，保证其骨密度降低、骨小梁稀疏发生，构建骨质疏松模型。

1.7.4双基因活化纳米骨浆用于骨质疏松效果观察 选取骨质疏松模型构建成功的双侧卵巢切除山羊每只L2～L6椎体，麻醉后向其中4只经椎弓根填充纳米骨浆，其他4只填充BMP-2基因活化纳米骨浆，其他2只作为空白对照组不注射纳米骨浆。注射成功后4个月将山羊处死，将椎体取出后检测其骨密度及结构力学强度，检测并对比各组脊柱椎体最大压缩应力及最大压缩载荷。

1.8统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。

2 结 果

2.1BMP-2基因活化骨浆构建情况 使用购自华中科技大学BNP-2基因活化骨浆开展RT-PCR验证，结果显示BMP-2基因活化骨浆BMP-2水平表达明显增加，与实验要求相符。其中空白对照组30个椎体平均BMP-2相对表达为(1.02±0.24)，基因活化的纳米骨浆15个，椎体平均BMP-2相对表达为(5.21±0.85)。基因活化的纳米骨浆表达明显较空白对照组增强，差异有统计学意义(t=25.309，P<0.01)。

2.2椎体最大载荷比较 BMP-2基因活化纳米骨浆组最大压缩应力、最大压缩载荷均显著高于空白对照组与纳米骨浆组，差异有统计学意义(P<0.05)，空白对照组与纳米骨浆组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同山羊模型脊柱椎体最大载荷比较

与空白对照组比较：1)P=0.516,2)P=0.085;3)P=0.003,4)P<0.001;与纳米骨浆组比较：5)P=0.039,6)P=0.033

2.3各山羊模型组血液生化指标水平表达比较 术前，正常组、假手术组、双侧卵巢切除术组山羊模型血清骨钙素、碱性磷酸酶水平表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；术后6个月，双侧卵巢切除术组山羊模型血清骨钙素、碱性磷酸酶水平表达均较其他两组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；正常组与假手术组术后6个月血清骨钙素、碱性磷酸酶水平较术前未见明显变化，且组间表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。术后6个月，选择正常组与双侧卵巢切除术组山羊模型中1只动物进行Micro CT扫描，结果显示双侧卵巢切除术组山羊模型骨密度显著降低，骨小梁稀疏，骨质疏松模型构建成功。见图1～2。

2.4双基因活化纳米骨浆用于骨质疏松山羊模型对脊柱椎体载荷的影响观察 3组骨质疏松山羊模型中，BMP-2基因活化纳米骨浆组最大压缩应力、最大压缩载荷最高，其次为纳米骨浆组，空白对照组最低，组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。在纳米骨浆注射后4个月，将山羊模型处死后，选择纳米骨浆组与BMP-2基因活化纳米骨浆组各1只山羊模型，将其椎体取出检测骨密度及结构力学强度，结果显示，较纳米骨浆组，BMP-2基因活化纳米骨浆组山羊模型脊柱椎体骨密度、最大压缩应力均增加，椎骨小梁致密程度好，且孔隙率更低。见图3、4。

表2 各山羊模型组血液生化指标水平表达比较

与同组术前比较：1)P<0.05；与正常组比较：2)P=0.706,3)P=0.102,4)P=0.756,5)P=0.742,6)P=0.767,7)P<0.001,8)P=0.502,9)P=0.002；与假手术组比较：10)P=0.560,11)P<0.001,12)P=0.642,13)P=0.015

图1 正常组三维重建图像

图2 双侧卵巢切除术组三维重建图像

表3 3组骨质疏松山羊模型脊柱椎体载荷比较

与空白对照组比较：1)P=0.041,2)P=0.024,3)P=0.008,4)P=0.002;与纳米骨浆组比较：5)P=0.046,6)P=0.037

图3 骨质疏松山羊模型注射纳米骨浆4个月后三维重建图

图4 骨质疏松山羊模型注射BMP-2基因活化纳米骨浆4个月后三维重建图

3 讨 论

目前，经椎弓根内固定技术已成为脊柱内固定邻域的重要内容，椎弓根螺钉可经牵引、加压及旋转等方式为脊柱提供理想矫治，从而帮助脊柱获得接近正常的解剖位置〔8〕。椎弓根螺钉获得的骨-螺钉界面握力是否足够决定了椎弓根螺钉固定的优越性，且提供的握力应持续至椎体骨性融合完全达到稳定，椎弓根螺钉固定成败取决于椎弓根螺钉置入成功与否〔9〕。但目前，在实际临床工作中，接受椎弓根螺钉固定者多为老年患者，这类患者常合并不同程度骨质疏松，骨质疏松的存在在一定程度上可降低椎弓根螺钉固定能力，致使螺钉松动，导致椎体间融合失败〔10，11〕。

为解决骨质疏松导致的椎弓根螺钉强度不佳等情况，临床常常通过增加螺钉长度与直径、对钉道进行不攻丝或预攻丝、钉道经骨质填充、使用骨水泥等材料填充钉道等方法来提高椎弓根的固定强度，但这些手段依然有其不足之处，无法达到临床预期〔12，13〕。骨质疏松不仅会影响到椎弓根螺钉强度，同时患者本身也极易发生各种骨改变，如骨小梁减少、骨质减少、骨小梁间隙增加等，因骨小梁减少，故合并骨质疏松的人群较其他人更容易发生骨折〔14，15〕。基因纳米骨浆是将基因与纳米骨浆向融合并经基因真核表达载体所构建的一种纳米骨浆的延续，构建出来的填充物同时拥有基因及纳米骨浆自身优势〔16，17〕。具有高仿生特性的纳米骨浆，在使用后一方面能创造适宜微环境为胶原与矿物质沉积提供条件，一方面可推动成骨细胞的黏附，加速细胞与生物材料间的交互作用，帮助成骨细胞分化，在纳米骨浆基础上加入BMP-2载体，获得的生物材料在植入后能够发挥理想的生物学效应，增加成骨细胞生成能力〔18～20〕。

本研究结果提示BMP-2基因活化纳米骨浆的注射能够显著增加椎骨对外界压力的承受能力。提示，BMP-2基因活化纳米骨浆较普通纳米骨浆对合并骨质疏松的骨折患者椎体成形术脊柱椎体间融合的影响更好。但值得注意的是，因该技术尚未被过多用于临床实际，研究结果的真实性尚无较多循证依据可以支持，结论的可靠性还应在未来展开相关实验研究加以证实。

综上所述，BMP-2基因活化纳米骨浆较普通纳米骨浆更利于提高脊柱椎体骨密度及生物力学强度，在促进脊柱椎体间融合方面应用价值高，可作为合并骨质疏松骨折患者椎体成形术理想的填充材料。