蓝丹纯 廖荣臻 李知行 张弘弢 李子勇

(1佛山市中医院，广东 佛山 528000；2广州中医药大学第三附属医院；3深圳市中医院；4广东省中医院)

全世界大约11个成年人中有1个患有糖尿病，而90%为2型糖尿病(T2DM)。亚洲是迅速出现的全球T2DM流行主要地区，而中国和印度是其中的两大重灾区。心脑血管并发症是这些患者发病率和死亡率的主要原因〔1〕。胰岛素抵抗(IR)是高血压、冠心病的独立危险因素〔2〕，大量基础研究亦表明血管内皮的IR在心脑血管疾病的进展中起着重要作用，并与炎症反应之间相互影响、相互促进〔3，4〕。针灸作为古老的治疗手法，不论是改善IR，还是调节血管内皮功能，其良好的治疗作用均已经得到临床验证〔5，6〕。本研究采用高脂饮食诱导IR大鼠模型，以血管内皮细胞为靶点，观察针刺干预对血管内皮细胞核因子(NF)-κB p65蛋白及其磷酸化水平的影响，并进一步探讨炎症反应与IR相互作用及治疗效应关系。

1 材料与方法

1.1实验动物 动物选用广州中医药大学实验动物中心提供的雄性SPF级SD(Sprague Dawley)大鼠24只，使用许可证号：SYXK(粤)2013-0001。并于该中心SPF级环境内完成整个实验过程。高脂饲 料配方(D12492，质量比)：蛋白26.2%，碳水化合物26.3%，脂肪34.9%(购于广东省实验动物中心)；普通饲料配方(质量比)：豆粕21%，稻谷4%，玉米31%，小麦18%，黄豆2%，鱼粉6%，预混料3.5%，麸皮10%，蛋黄粉3%，植物油1.5%，多种维生素1%(购于广州中医药大学实验动物中心)。本实验在实验室动物护理和使用的伦理指导原则下进行。

1.2主要试剂及仪器 肿瘤坏死因子(TNF)-α及白细胞介素(IL)-6试剂盒均购eBioscience公司；空腹胰岛素(FINS)测定试剂盒购自默科迪亚公司；NF-κB p65 及p-NF-κB p65抗体试剂盒购自美国CST公司；胰岛素注射液(诺和灵R，EVG3439)；TEM-1200EX型透射电镜；G6805-2A型低频电子脉冲治疗仪(YZB/沪0735-26-2009)；血糖仪(罗氏血糖仪)；微量注射泵：(YZB/粤0641-2008)；针灸针(华佗牌，规格：0.35 mm×13 mm)。

1.3穴位定位 本实验所选的穴位定位〔7〕：①肾俞：大鼠后背部第二腰椎下旁开0.5 cm处；②足三里：大鼠后肢膝关节外下方，即腓骨小头下约0.5 cm处；③三阴交：大鼠后肢内踝尖直上1 cm处；④内关：前肢内侧，离腕关节约0.3 cm的尺桡骨缝间。

1.4实验分组 将24只SD大鼠随机地平均分配至空白组、模型组及电针组各8只。空白组大鼠喂以普通饲料12 w；模型组及电针组大鼠喂以D12492高脂饲料12 w以诱导IR模型。予以电针组大鼠针刺干预，同侧的足三里及三阴交给予疏密波(疏波2 Hz，密波50 Hz，调制频率10次/min)的电流刺激，刺激强度以局部肢体轻微抖动为度，20 min/次，1次/d，持续治疗28 d。

1.5标本采集及检测

1.5.1高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验〔8〕待全部大鼠禁食不禁水8 h后，将充分麻醉的大鼠固定于鼠板上，钝性分离大鼠的左侧颈总动脉及右侧颈外静脉，而后分别于其中插送深约2.5 cm的PE管(PE管中已预先注入80 U/ml的肝素生理盐水溶液)，并将PE管稳固于肩胛部皮下；右侧颈静脉PE导管末端连接三通旋塞，接通微量泵端口，分别输注胰岛素及葡萄糖。首次0 min经颈动脉取血采样，检测基础胰岛素和基础血糖(BBG)，而后以速率为0.12 U/(kg·h)恒速输入0.05 U/ml的胰岛素溶液。每隔5 min测一次大鼠的空腹血糖(FPG)值，当FPG值超过(BBG±0.5)mmol/L范围时，可泵注20%的葡萄糖溶液，并且每隔10 min采血检测FPG，而后根据波动的血糖值调整糖的泵注速率，使FPG值稳定维持在(BBG±0.05)mmol/L上下。等达到机体稳态后，则每5 min采血测定FPG，取稳态下6次葡萄糖输注速率(GIR)的平均值作为GIR，GIR=稳态时GIR×葡萄糖浓度×1 000/体重(kg)/60；取稳态下6次FPG的平均值作为稳态下的FPG。

1.5.2检测方法 整个治疗疗程结束后，禁食不禁水12 h，次晨于麻醉后眼眶静脉窦采血。采用葡萄糖氧化酶法测定FPG；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定FINS，所有步骤按说明书严格操作；采用液相芯片技术(Luminex/2000)测定TNF-α、IL-6水平。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，截取大小约3 mm×2 mm的主动脉置于2.5%戊二醛溶液中固定，备透视电镜观察，余下的主动脉置于冻存管并于-20℃下保存，用于Western印迹检测。

1.6统计方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析，方差齐性用LSD比较，方差不齐用Tamhane比较。

2 结 果

2.1针刺前后IR模型大鼠血清FPG、FINS、GIR的变化 针刺前，模型组GIR、FPG及FINS较电针组无明显差异(P>0.05)，与空白组比较，其余两组GIR水平显著降低，FPG及FINS水平显著升高(P<0.01)。针刺后，模型组、电针组大鼠血清FPG、FINS水平较空白组显著升高(P<0.01)，GIR水平明显降低(P<0.01，P<0.05)；电针组大鼠血清FPG、FINS水平较模型组显著降低，GIR水平明显升高(P<0.01)。见表1。

表1 针刺前后各组FPG、FINS及GIR的比较

与空白组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.01

2.2电针对IR模型大鼠血清TNF-α及IL-6的影响 模型组大鼠的血清TNF-α、IL-6较空白组明显升高(P<0.01)。电针组大鼠血清TNF-α、IL-6水平较模型组明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 各组血清TNF-α及IL-6比较

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，下表同

2.3电针对IR模型血管NF-κB p65蛋白表达的影响 模型组、电针组血管内皮的磷酸化(p)-NF-κB p65水平及蛋白表达较空白组显著升高(P<0.01)，电针组血管内皮p-NF-κB p65水平及蛋白表达较模型组显著降低(P<0.01)。见表3、图1。

2.4电针对IR模型大鼠血管内皮超微结构的影响 在透视电镜下可见，空白组大鼠主动脉的内皮层完整连续平滑，紧贴于动脉壁内层，细胞下间隙连接紧密，线粒体形态无明显异常；模型组大鼠内皮细胞下层疏散，扁平细胞与动脉壁间隙增宽，线粒体形态异常，壁上出现多量的空泡样线粒体；电针组中大鼠的内皮细胞与壁间隙稍增宽，部分线粒体形态改变，嵴部局部消失。见图2。

表3 各组血管 内皮NF-κB p65蛋白表达的比较

图1 各组主动脉NF-κB p65 Western印迹比较

a内皮细胞；b 壁下间隙；c 线粒体 图2 各组血管内皮超微结构(×15 000)

3 讨 论

T2DM的主要诱因是过多高热量饮食摄入而导致的肥胖。其引起的机体过多脂肪堆积会使得机体长期处于慢性炎症反应状态，慢性炎症是IR的主要原因之一〔9〕。而血管IR的表现为因胰岛素引起的血管舒张异常而导致血管内皮功能障碍〔10〕。内皮功能障碍是血管疾病的初始阶段，是心血管和代谢疾病(如动脉粥样硬化、高血压或糖尿病)的强有力预测因子〔11，12〕。同时内皮功能障碍也是T2DM自然史上最早发现的功能紊乱。此与机体长期高水平的血糖浓度及炎症状态密不可分〔13〕。当IR加速着T2DM疾病进展的同时，心脑血管疾病也在血管功能障碍诱发下逐渐地显现出来〔14，15〕。

本研究结果说明电针可提高外周胰岛素敏感性。NF-κB是炎症的主要调节因子，表达促炎细胞因子，如IL-1β和IL-6，通常以p50和p65亚基及抑制蛋白κB抑制因子(IκB)α组成的无活性复合物形式存在。其中，NF-κB p65具有较强的转录活性及DNA结合亲和力〔16〕。在细胞溶质中，NF-κB与IκBα相关，后者控制着NF-κB的核易位。IκBα的降解导致NF-κB激活，从而调节基因表达。近年来，NF-κB的磷酸化，特别是NF-κB p65的磷酸化已成为转录激活的新机制〔17〕。研究结果发现，脂肪堆积状态能激活机体中的NF-κB，而抑制NF-κB通路可以减轻高脂肪饮食引起的肥胖〔18〕。

一方面，机体的慢性炎症状态直接改变胰岛素靶器官血管内皮的结构，破坏了机体的保护屏障。此外，脂毒性或者炎症状态触发着内皮功能障碍，从而诱发内皮层的病理改变。另一方面，血管内皮细胞线粒体的数量或形态的改变，都将影响线粒体呼吸链的功能，阻碍机体的糖脂代谢，最终诱发糖脂毒性〔19〕。而增加的活性氧激活了NF-κB 信号通路，进一步增加炎性因子的表达，从而又使内皮损伤及IR进一步恶化〔20〕。

本研究所选的4个穴位，具有补益肾脾之功，可有效降低大鼠空腹血糖及空腹胰岛素水平，增强靶器官胰岛素敏感性，逆转IR现象，再次验证了既往的研究结果。此外，本研究结果发现，电针组大鼠主动脉内皮细胞层在经过电针的干预治疗后，动脉内皮层病理状态得到了改善，此与NF-κB信号通路调控慢性炎症密不可分。