杜锐玲 杨茂农

(四川省人民医院中医科，四川 成都 610072)

胃癌(GC)，是常见的上消化道恶性肿瘤之一，尤其在幽门螺杆菌感染者中更为高发〔1〕。GC的病理类型以腺癌为主，临床上GC症状隐匿，已发生淋巴结及肝脏转移，故患者术后长期生存率较低〔2〕。

微小核糖核苷酸(miR)是一种单链短RNA〔3〕。miR-1301的异常表达与癌症的发生发展密切相关。例如，miR-1301在甲状腺癌中表达下调并且与肿瘤体积和淋巴结转移等恶性临床特征密切相关〔4〕。预后分析发现，低表达miR-1301的卵巢癌患者预后不良，且miR-1301的低表达是患者不良预后的独立危险因素之一〔5〕。但是，miR-1301在GC中的表达、临床意义及生物学功能尚不完全清楚。本研究旨在探索miR-1301对GC侵袭的影响，以期对miR-1301成为GC分子治疗靶标提供理论依据。

1 材料和方法

1.1组织标本 四川省人民医院2013年1月至2015年12月收治的60例GC组织与对应癌旁组织，男40例，女20例。

1.2细胞来源及主要试剂 GES-1、MGC-803、SGC-790、MKN45、AGS细胞由四川省人民医院中医科实验室保存；miR-1301(miR10005797-1-5)及阴性对照(miR01201-1-5)mimics购自广州锐博生物技术公司；miR-1301(miRQ0005797-1-1)及U6(MQP-0201)引物购自广州锐博生物科技有限公司；Trizol试剂(15596026)、RT-PCR试剂盒(SuperScript®One-Step RT-PCR System with Platinum®Taq DNA Polymerase,10928042)、qPCR试剂盒(DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit，F415L)及转染试剂Lipofectamine 2000(11668-027)均购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国康宁公司，兔抗人STAT3多克隆抗体(12640)、基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体(40994)及鼠抗人β-actin单克隆抗体(3700)均购自美国CST公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；DMEM液体细胞培养基购自Mediatech公司；基质胶购自美国BD公司。

1.3qRT-PCR 标本及细胞RNA由Trizol试剂提取。反转录PCR条件设定为：50℃ 30 min，94℃ 2 min，循环次数1；94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 3 min，循环40次；72℃ 10 min。通过2-△△Ct法检测组织及体外培养细胞中miR-1301的相对含量。

1.4细胞培养及mimics转染 MGC-803细胞于适宜条件下培养至稳定传代。将MGC-803细胞按适宜密度接种6孔板。实验分组：miR-1301组(miR-1301)每孔加入100 pmol的miR-1301 mimics、2 ml完全培养基及5 μl Lipofectamine 2000；阴性对照(miR-control)组每孔加入100 pmol的miR-control mimics、2 ml完全培养基及5 μl Lipofectamine 2000。转染24 h后进行下一步实验。

1.5Transwell小室 按1∶8比例采用无血清DMEM培养液稀释基质胶后，按每孔100 μl包被Transwell小室膜的上室面，制作侵袭小室模型；无基质胶包被的Transwell小室用于细胞迁移实验。取对数生长期的MGC-803细胞以无血清培养基按每孔2万个接种于上室，下室内加入750 μl含10%血清的完全培养基。培养24 h后移除培养基，甲醛固定细胞，结晶紫染色。倒置白光显微镜下观察细胞侵袭，计数迁移或者侵袭细胞数目。

1.6Western印迹 RIPA试剂提取细胞总蛋白，凝胶垂直电泳分离蛋白，70 V恒压转膜150 min，5% 牛血清白蛋白封闭1 h后将条带孵育于1∶1 000比例稀释的相应一抗中。4℃过夜后，使用1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗孵育条带1 h。电化学发光(ECL)法曝光条带。

1.7统计学处理 采用SPSS13.0软件进行χ2检验，t检验，Kaplan-Meier生存曲线。

2 结 果

2.1miR-1301在GC组织中低表达 通过荧光实时定量PCR检测发现,60例GC组织中miR-1301的表达水平(0.581±0.043)明显低于癌旁组织(1.338±0.056，t=2.419，P=0.026)。

2.2miR-1301表达与GC临床病理特征及患者预后的关系 以GC组织中miR-1301在GC组织中平均表达水平为界值，将60例GC组织分为miR-1301高表达组(n=22)及低表达组(n=38)。统计结果表明，淋巴结转移较多出现在miR-1301低表达的GC患者中(P<0.05)，提示miR-1301可能与肿瘤侵袭转移相关。见表1。

表1 miR-1301表达的临床病理意义分析(n)

Hp：幽门螺杆菌

通过术后随访，获得了上述两组3年的生存资料，使用Kaplan-Meier生存曲线法分析后发现，miR-1301低表达组3年总体生存率(HR=2.140，P=0.021)及无病生存率(HR=3.437，P=0.015)较miR-1301高表达组更低。见图1。多因素分析发现，淋巴结转移、miR-1301低表达是GC患者预后不良的独立危险因素之一(P<0.05)，见表2。

图1 miR-1301异常表达对患者预后的影响

表2 GC患者术后3年生存率相关因素的COX比例风险回归分析(n=60)

2.3miR-1301对GC细胞迁移及侵袭的影响 为研究miR-1301在GC中的生物学功能，本研究利用基因转染技术构建了miR-1301过表达细胞模型。转染miR-1301 mimics的细胞内miR-1301表达水平较miR-control组明显升高〔miR-control组为1.03±0.28、miR-1301组为9.46±1.38，t=10.285，P=0.009)。通过Transwell迁移小室模型的检测得知，miR-1301组迁移细胞数量为(21.11±3.25)个，miR-control组迁移细胞数量为(42.38±5.01)个，差异具有统计学意义(t=6.423，P=0.021)个。同样，miR-1301组侵袭细胞数量为(10.29±2.04)个，miR-control组侵袭细胞数量为(23.46±3.18)个，差异具有统计学意义(t=3.128，P=0.030)。见图2。

图2 miR-1301对MGC-803细胞迁移、侵袭的影响(×100)

2.4过表达miR-1301对下游靶点STAT3的调控作用 过表达miR-1301抑制STAT3蛋白和MMP-2 mRNA表达水平。见图3。

图3 过表达miR-1301对MGC-803细胞内STAT3及MMP-2表达的影响

为验证STAT3是否为miR-1301的潜在作用靶点，本研究通过Western印迹检测了过表达miR-1301后MGC-803细胞内STAT3表达的变化。结果表明，miR-1301组MGC-803细胞内STAT3蛋白表达水平为(0.13±0.05)，miR-control组STAT3蛋白表达水平为(0.51±0.10)，差异有统计学意义(t=3.781，P=0.028)。通过Western印迹检测了MMP-2的表达，结果发现，miR-1301组细胞MMP-2蛋白表达水平为(0.23±0.04)，miR-control组MMP-2蛋白表达水平为(0.42±0.09)，差异有统计学意义(t=2.168，P=0.036)。

3 讨 论

MMP-2是STAT3调节肿瘤侵袭能力的效应基因之一〔6〕。miR-1301作为一种新发现的microRNA，其在不同类型的恶性肿瘤中的生物学功能并不完全相同。在前列腺癌中，miR-1301高表达并促进肿瘤细胞干性〔7〕；而在乳腺癌中，miR-1301却抑制了肿瘤细胞的增殖〔8〕。本研究我们通过PCR检测得知，GC组织中miR-1301的表达水平呈明显降低趋势。临床数据分析结果显示，低表达miR-1301的患者多存在淋巴结转移，且这部分患者预后较差。这表明miR-1301在GC中的缺失导致了肿瘤发生转移，造成患者早期复发和死亡。为验证这一假设，本研究结果证实，miR-1301具有削弱肿瘤细胞迁移及侵袭的效果。另外，最新文献也指出，miR-1301也能够抑制肿瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡〔9〕。说明miR-1301的抗肿瘤效应具有生物多样性，值得我们在今后的工作中进一步深入研究。

MicroRNA能够通过结合靶基因(3′-UTR)区而发挥负向调控作用〔10〕。通过生物信息学检索分析我们发现，STAT3可能是miR-1301的下游靶点之一。既往研究〔11〕也表明STAT3在胃癌内高表达且具有促癌作用。通过蛋白印迹试验我们发现，过表达miR-1301在体外的确能下调STAT3的表达水平。MMP对肿瘤侵袭转移均具有促进作用〔12〕。STAT3是一种重要的癌性转录因子，研究指出，MMP-2的转录受到STAT3的调节〔13〕。本研究提示miR-1301的抑制肿瘤迁移及侵袭作用可能是通过抑制STAT3/MMP-2信号通路的活化来实现的。

关于miR在肿瘤中异常表达的机制，目前认为主要与两方面因素有关：一是，长链非编码RNA(lncRNA)作为分子海绵结合microRNA，导致microRNA的表达下降，并失去生物活性。第二种潜在的机制是miR表达的表观遗传学调控。对于miR-1301，有研究显示，LINC01433能够促进肝细胞癌的进展，其机制正是通过结合并下调miR-1301的表达而实现的〔14〕。在甲状腺癌中的研究结果还指出，由STAT3上调的LncRNA ABHD11-AS1能够通过与miR-1301相结合而抑制其生物学功能〔15〕，这一结果提示STAT3-miR-1301在肿瘤中可能存在一个负反馈关系，但仍需在今后的研究中进一步证实。

综上，miR-1301在GC中低表达，miR-1301抑制GC侵袭的作用可能是通过调控STAT3/MMP-2信号通路的活化来实现的。