张兰兰，邓杰，郭燕，徐升东，黎仲冰，卫春会*

(1.四川轻化工大学酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000； 2.四川省阆州圣果酒业有限公司，四川 阆中 637400；3.中国人民解放军原济南军区新技术农副业生产基地，山东 邹城 273517)

桑葚(mulberry)是桑科桑属植物成熟果穗的统称，又名桑乌、桑果、桑枣[1]。果实味甜汁多，色泽鲜艳，颜色主要有黄棕色、棕红色至暗紫色[2]。桑葚营养成分丰富，含有多种人体必需氨基酸、微量元素及维生素[3]。同时桑葚还是中药，具有乌发明目、补虚祛湿等功效，属于药食同源的食物[4]，被誉为“民间圣果”、“百果之先”等美名[5]。桑葚中起显著作用的是花青素，花青素(anthocyanidin)属黄酮化合物，有很强的抗氧化能力，能够促进人体健康[6,7]。食用它不仅能够美容养颜、护肝、抗肿瘤、抗氧化、预防动脉硬化等，还具有显著提高人体免疫力的功效[8-10]。花青素还能改善大脑发育过程中乙醇诱导的神经毒性[11]，预防大脑动脉闭塞、再灌注损伤和促进刺激视紫红质再生等[12,13]。随着生活水平的提高，人们对合成色素安全的担忧日渐显著，花青素作为一种天然色素，安全、无异味、资源丰富，而且具有一定的营养和药理作用，在食品、饮料、化妆品、医药方面有着较大的应用潜力[14]。

目前，对花青素的稳定性和抗氧化活性有不少研究，卓毓光等[15]通过分析影响花青素稳定性的因素，总结了提高花青素稳定性的途径；侯巧芝等[16]研究表明桑葚花青素抗氧化活性随着浓度的增大呈线性增强。针对花青素提取研究常用的方法有超声波-乙醇法、超声波提取法、微波提取法等[17]。但通过乙醇溶剂浸取法提取桑葚花青素的研究并不多，因此，对乙醇溶剂浸取法提取花青素的研究是很有必要的。本研究采用乙醇溶剂浸取法提取桑葚花青素，通过单因素和正交设计对花青素的提取条件进行优化，确定最佳乙醇溶剂浸取花青素工艺，从而为桑葚深加工技术提供理论与技术支持，为高效利用开发桑葚花青素打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料及预处理

桑果干：由四川省阆州圣果酒业有限公司提供。

将桑果干在干燥箱中烘干，再用粉碎机打成粉末状，过20目筛，放于干燥器中密封储藏备用。

1.1.2 试剂

95%乙醇、浓盐酸、乙酸钠、氯化钾等均为分析纯，购自成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器设备

UV-1200型紫外可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Starter 2100型pH计 奥豪斯仪器(上海)有限公司；XMTD-4000型电热恒温水浴锅 上海科恒实业发展有限公司；AR2140型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；1500型酶标仪 赛默飞世尔科技有限公司；BM255C型粉碎机 广东美的精品电器制造有限公司；LabServ.LS.0610型干燥箱 飞世尔试验器材(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 缓冲液的配制

pH 1.0氯化钾-盐酸缓冲的液配制：①精确称取7.45 g的KCl固体放置于烧杯中，在容量瓶中用蒸馏水定容至500 mL，配成0.2 mol/L KCl溶液；②精确量取8.5 mL浓盐酸在容量瓶中用蒸馏水定容至500 mL，配成0.2 mol/L HCl溶液；③将KCl溶液与HCl溶液以25∶67的比例混合，再用KCl溶液调pH至1.0±0.1[18]。

pH 4.5醋酸钠-盐酸缓冲液的配制：精确称取16.4 g的NaAc在容量瓶中用蒸馏水定容到1000 mL，再用盐酸调pH至4.5±0.1。

1.3.2 最大吸收波长Amax及吸光值A的检测

称取粉碎后的干桑葚5.0 g，加入10 mL 50%乙醇浸提15 min，抽滤后得到花青素粗提取液，再取5 mL花青素提取液，分别用pH 1.0氯化钾缓冲液或pH 4.5醋酸钠缓冲液稀释10倍后，将稀释液静置15 min，用酶标仪在440～600 nm波长范围内分别测定两种提取稀释液，从440 nm开始的吸光值A，波峰处的波长值为最大吸收波长即Amax。

1.3.3 吸光值A及样品花青素含量C的测定

花青素的含量测定采用pH示差法，公式如下：

A=(Amax-A700)pH 1.0-(Amax-A700)pH 4.5。

(1)

C(mg/g)=(A/εL)×Mw×DF×V/Wt。

(2)

式中：A为总吸光值；Amax为最大吸收波长值；A700为波长为700 nm的吸光值；ε为Cy-3-Glu的消光系数(其值为26900 L/(mol·cm)；Mw为Cy-3-Glu的相对分子质量(449.2 g/mol)；DF为稀释倍数；V为总取液体积(mL)；Wt为样品质量(g)；L为光程(1 cm)。

1.3.4 工艺流程

原料桑葚果干→粉碎→过筛(20目筛)→乙醇溶剂浸提→抽滤→取样测定吸光值→计算含量→旋转浓缩→冷冻干燥→花青素粗品。

1.4 单因素试验设计

分别考察乙醇体积分数、料液比、溶剂pH、提取时间、提取温度5个因素对桑葚花青素提取量的影响。

1.4.1 乙醇体积分数的确定

称取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中，在pH为4.0、提取温度为40 ℃、提取时间为60 min、料液比为1∶10 (g/mL)的情况下，考察乙醇体积分数分别为45%、55%、65%、75%、85%对桑葚花青素提取量的影响。

1.4.2 料液比的确定

称取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中，在pH为4.0、提取温度为40 ℃、提取时间为60 min、乙醇体积分数为的65%情况下，考察料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 (g/mL)对桑葚花青素提取量的影响。

1.4.3 溶剂pH的确定

称取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中，在提取温度为40 ℃、提取时间为60 min、料液比为1∶10 (g/mL)、乙醇体积分数为65%情况下，考察溶剂pH分别为2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0对桑葚花青素提取量的影响。

1.4.4 提取时间的确定

称取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中，在pH为4.0、提取温度为40 ℃、料液比为1∶10 (g/mL)、乙醇体积分数为65%的情况下，考察提取时间分别为60,90,120,150,180 min对桑葚花青素提取量的影响。

1.4.5 提取温度的确定

称取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中，在pH为4.0、提取时间为60 min、料液比为1∶10 (g/mL)、乙醇体积分数为65%的情况下，考察提取温度分别为30,40,50,60,70 ℃对桑葚花青素提取量的影响。

1.5 正交试验设计

在单因素试验基础上，选择料液比、提取温度、乙醇体积分数为变量，以花青素提取量为评价指标，设计4因素3水平L9(34)正交试验，从而确定桑葚花青素的最佳工艺条件。

2 结果与分析

2.1 最大吸光值Amax的确定

在440～600 nm波长范围内分别测定两种提取稀释液，桑葚果中花青素最大吸收波长测定曲线见图1。

图1 桑葚花青素最大吸收波长测定曲线Fig.1 Measuring curves of the maximum absorption wavelength of anthocyanins in mulberry

由图1可知，两条折线均在波长530 nm处出现波峰，吸光值达到最大，因此，采用波长为530 nm测定提取液的吸光值，并通过示差法计算花青素样品吸光值A。

2.2 单因素条件对桑葚花青素含量的影响

2.2.1 乙醇体积分数对桑葚花青素提取量的影响

本试验考察了不同乙醇体积分数对桑葚花青素提取量的影响，结果见图2。

图2 不同乙醇体积分数对花青素提取量的影响Fig.2 Effect of different ethanol volume fractions on anthocyanins extraction amount

由图2可知，随着酸性乙醇体积分数的增加，桑葚花青素提取量不断增大，在酸性乙醇体积分数为65%时达到最大，继续提高酸性乙醇体积分数，提取量反而逐渐降低。在酸性乙醇体积分数较低时，糖类、果胶和其他水溶性物质的溶解性好，影响了花青素的溶出，导致花青素的提取量较低[19]；当酸性乙醇体积分数过高时，脂溶性物质易溶出[20]，影响花青素溶出，导致花青素提取量偏低。因此，选取体积分数65%的乙醇溶液。

2.2.2 料液比对桑葚花青素提取量的影响

本试验考察了不同料液比对桑葚花青素提取量的影响，结果见图3。

图3 不同料液比对花青素提取量的影响Fig.3 Effect of different solid-liquid ratios on anthocyanins extraction amount

由图3可知，随着提取液料液比的增大，桑葚花青素提取量呈现先增加后减小的趋势，表明在一定范围内提高料液比有利于提高花青素含量；在料液比为1∶10 (g/mL)时花青素浓度为2.4 mg/g，当料液比低于1∶10 (g/mL)时，桑葚花青素提取不完全；当料液比超过1∶10 (g/mL)时，花青素可能在酸性条件下被破坏，从而导致花青素提取量减少。故选择料液比为1∶10 (g/mL)。

2.2.3 溶剂pH对桑葚花青素提取量的影响

本试验考察了不同溶剂pH对桑葚花青素提取量的影响，结果见图4。花青素在酸性条件下比较稳定，因此将提取剂pH调为2～5。

图4 不同乙醇溶液pH对花青素提取量的影响Fig.4 Effect of different pH values of ethanol solution on anthocyanins extraction amount

由图4可知，随着pH的变化，桑葚花青素浓度变化，pH先逐渐增大后降低，在pH值达到4.0时，提取量达到最大值。pH过低，导致花青素的糖苷键断裂，从而使花青素吸光值较低；pH增大，提取出的花青素提取量反而减小，可能是因为pH过高影响花青素的稳定性，进而使花青素吸光值减小。因此，本试验选择提取液的pH为4.0。

2.2.4 提取时间对桑葚花青素提取量的影响

本试验考察了不同提取时间对桑葚花青素提取量的影响，结果见图5。

图5 不同提取时间对花青素提取量的影响Fig.5 Effect of different extraction time on anthocyanins extraction amount

由图5可知，在提取时间为60～180 min范围内，随着提取时间的延长，花青素提取量先上升后下降，当水浴浸提时间达到120 min时，提取的花青素提取量达到最大值。分析可能是花青素长时间在较高的水浴温度下发生氧化或降解，使花青素被破坏，故提取量降低。根据试验结果，选取120 min为水浴浸提的最佳时间。

2.2.5 提取温度对桑葚花青素提取量的影响

本试验考察了不同提取温度对桑葚花青素提取量的影响，结果见图6。

图6 不同提取温度对花青素提取量的影响Fig.6 Effect of different extraction temperatures on anthocyanins extraction amount

由图6可知，随着提取温度由高到低，花青素含量呈现先上升后下降的趋势。在60 ℃达到最大值，这说明在一定范围内升高温度有利于花青素的提取。随着温度增加，花青素提取量逐渐增大，主要是因为温度能提高花青素在溶剂中的溶解度和扩散速度，也有利于细胞的破坏，提高细胞膜的通透性；温度继续上升，花青素的提取量缓慢下降，主要是因为温度过高，桑葚花青素的稳定性遭到部分破坏，使提取量有所下降，根据试验结果选择提取温度为60 ℃。

2.3 桑葚花青素提取正交试验及结果

为了确定桑葚花青素的最佳工艺条件，在单因素试验基础上设计正交试验。对比单因素试验结果，结合实际试验现象，发现料液比、提取温度和乙醇体积分数3个因素的花青素提取量变化幅度比较大，且受外界影响比较大，而溶剂pH和提取时间对花青素提取的影响相对比较稳定，且提取量的变化也比较清晰直观。因此，选择料液比、提取温度、乙醇体积分数为变量。

在提取时间120 min，溶剂pH 4.0条件下，以花青素的提取量为评价指标，设定4因素3水平L9(34)正交试验，结果见表1，方差分析见表2。

表1 乙醇溶剂浸取法花青素提取正交表Table 1 Orthogonal table of anthocyanins extracted by ethanol solvent extraction method

表2 乙醇溶剂浸取法方差分析表Table 2 Variance analysis table of ethanol solvent extraction method

注：“*”表示对结果影响差异性显著(p<0.05)。

由表1可知，从极差值得到各因素对花青素提取量的影响大小为：料液比(B)>提取温度(A)>体积分数(C)，花青素提取量最佳提取条件组合为A2B2C1，即浸取温度60 ℃，料液比1∶10(g/mL)，溶剂体积分数为55%。

由表2可知，料液比对试验结果有显著影响(p<0.05)，提取温度、体积分数对桑葚花青素提取量无显著影响(p>0.05)。

2.4 工艺验证试验及结果

对上述正交试验极差分析结果A2B2C1进行验证试验，在提取时间为120 min，溶剂pH为4.0的条件下，进行5组平行试验，结果见表3。结果表明，正交试验极差分析工艺提取花青素含量为2.53 mg/g，故选择最佳提取条件组合为A2B2C1，即提取温度为60 ℃、料液比为1∶10 (g/mL)、体积分数为55%。

表3 乙醇溶剂浸提法验证试验结果Table 3 Verification test results of ethanol solvent extraction method mg/g

3 结论

本研究采用乙醇溶剂浸取法提取桑葚花青素，在乙醇体积分数、料液比、溶剂pH、提取时间、提取温度等单因素研究的基础上进行正交试验，对其提取工艺条件进行优化。从各因素的极差值发现其对花青素提取量的影响大小为：料液比>提取温度>体积分数，其中料液比对桑葚花青素提取量有显著性影响；通过工艺验证试验得到乙醇溶剂法提取花青素的最佳工艺条件为：乙醇体积分数为55%、料液比为1∶10 (g/mL)、提取温度为60 ℃、提取时间为120 min、溶剂pH为4.0，提取得到的桑葚花青素提取量为2.53 mg/g。

乙醇溶剂浸取法与其他提取方法相比，操作简单，设备投入少，乙醇成本低，安全且产率也比较可观，环保且能耗低，无论是实验室还是工业生产，均可推行，是很有应用前景的桑葚花青素提取方法。本研究优化确定了乙醇浸提桑葚花青素的提取工艺，后续将开展花青素纯化工艺，以期为今后桑葚花青素的规模化提取以及新产品开发提供理论依据。