于亚辉，方婷

(福建农林大学 食品科学学院，福州 350002)

鲍鱼，素有“软黄金”的美誉，同时也是八珍之首，我国是鲍鱼养殖大国，根据渔业统计年鉴，全国鲍鱼年产量自2008年到2017年的9年间，从3.30万吨增长到14.85万吨，增加了350%，已成为我国沿海养殖业的重要组成成分[1，2]。在鲍鱼的加工过程中，对产生的鲍鱼内脏和鲍鱼壳的研究开发已经开展了很多年[3]，但是对富含肽类及游离氨基酸的鲍鱼预煮液的研究开发较少[4]。

本实验首先研究了鲍鱼蒸煮液中游离氨基酸的组成及多肽含量，并以其为反应基液添加一定的氨基酸和还原糖等风味前体物质，通过美拉德反应制备海鲜风味基料，以感官评价为考核指标[5-7]，研究了葡萄糖添加量、精氨酸添加量、甘氨酸添加量、组氨酸添加量、半胱氨酸添加量、反应时间、反应温度、反应pH等条件下对风味基料的影响，对制备工艺进行优化，最后对其风味成分进行分析[8]。在提高鲍鱼蒸煮液附加值的同时，为海鲜风味基料的制备提供了参考及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与设备

鲍鱼蒸煮液：诏安海联食品有限公司。

葡萄糖、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、半胱氨酸、Gly-Gly-Tyr-Arg：西格玛试剂公司；双缩脲试剂：上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠、三氯乙酸：国药试剂公司；孔径0.45 μm滤膜：天津津腾实验设备有限公司；磷酸盐缓冲液：自制。

AX523ZH精密电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司；雷磁PHS-3C型pH 计 上海仪电科学仪器股份有限公司；Centrifuge 5430R小型高速冷冻式离心机 德国艾本德股份公司；电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 鲍鱼蒸煮浓缩液的制备

鲍鱼蒸煮液经0.45 μm滤膜过滤，55 ℃旋蒸去掉45%的水。

1.2.2 游离氨基酸的测定[9]

全自动氨基酸分析仪参数：日立离子交换树脂(4.6 mm×60.0 mm)；测定波长为570，440 nm；缓冲液流速0.5 mL/min；柱温20～85 ℃；进样量20 μL。

1.2.3 多肽含量的测定[10]

标准曲线的绘制：使用体积分数为5%的三氯乙酸将Gly-Gly-Tyr-Arg四肽配制成0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg/mL的标准溶液，然后取 6.0 mL标准溶液加入4.0 mL双缩脲试剂，混匀，静置10 min，6000 r/min离心10 min，取上清液于540 nm下测定OD值，以肽的浓度为横坐标X(mg/mL)，OD值为纵坐标Y制作标准曲线。

样品多肽的测定：取鲍鱼蒸煮浓缩液5.0 mL，加入5.0 mL体积分数为10%的三氯乙酸溶液，混匀，静置10 min，6000 r/min 离心10 min，将上清液倒入25 mL容量瓶中，并用5%的三氯乙酸定容，然后取6.0 mL样品加入4.0 mL双缩脲试剂混匀，静置10 min，然后6000 r/min 离心10 min，取上清液于540 nm下测定OD值，根据标准曲线求得鲍鱼蒸煮浓缩液中的多肽浓度(mg/mL)。

1.2.4 气相色谱-质谱条件

顶空固相微萃取条件：选用75 μm CAR/PDMS萃取头，萃取温度60 ℃，萃取时间20 min，解吸时间5 min。

色谱条件：气相色谱柱：RTX-5MS石英毛细管柱(30 m×25 mm×0.25 mm)；柱温：初始温度40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至260 ℃，保持20 min；进样口温度：280 ℃；载气：氮气；流量：1.0 mL/min；分流比：10∶1；质谱条件：采集方式：全扫描；质谱质量扫描范围：35～450 amu；电离方式：电子轰击(EI)；发射能量：70 eV；离子源温度：250 ℃；接口温度：260 ℃。

1.2.5 风味基料的制备

取30 mL鲍鱼蒸煮浓缩液，依次按比例加入葡萄糖、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、半胱氨酸搅拌均匀，并使用磷酸盐缓冲溶液及氢氧化钠溶液调节至一定pH，装入美拉德反应瓶(厚壁耐压瓶)后置于立式压力蒸汽灭菌器中，在一定温度下进行反应。

1.2.6 单因素试验

表1结合表2的基本配方，进行单因素试验，具体设计方案见表1和表2。

表1 单因素试验设计表Table 1 Single factor experimental design table

表2 制备风味基料基本配方及反应条件Table 2 Basic formula and reaction conditions for preparing flavor basic material

1.2.7 正交试验优化工艺条件

根据单因素试验结果，以感官评价为考虑依据，选择在反应条件及氨基酸添加量中对风味基料品质影响较大的因素，反应pH(A)、精氨酸添加量(B)、甘氨酸添加量(C)、半胱氨酸添加量(D)4个因素进行正交优化，因素及水平选取见表3。

表3 正交试验因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.8 感官评价方法及评价标准

对20名感官评价人员进行培训，选取10名人员组成感官评价小组对样品进行感官评价，每个样品重复2次，评价标准见表4，满分100分，最后取10名评价人员的平均分数为最终结果。

表4 风味基料评价标准Table 4 Evaluation standards of flavor basic material

2 结果与分析

2.1 四肽标准曲线及多肽含量测定

以Gly-Gly-Tyr-Arg四肽的浓度为横坐标X(mg/mL)，OD值为纵坐标Y制作标准曲线，见图1。得到回归方程y=0.0975x+0.0159，R2=0.9961。测得样品的OD值为0.0573，计算得鲍鱼蒸煮浓缩液的多肽含量为0.425 mg/mL。

图1 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线Fig.1 The standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg tetrapeptide

2.2 氨基酸组成成分分析

本实验采用的标样为37种氨基酸标样，尽可能全面分析鲍鱼蒸煮浓缩液中氨基酸的组成成分，其中脯氨酸和羟脯氨酸在波长440 nm处出峰，其他35种氨基酸在波长570 nm处出峰。

表5 样品中37种游离氨基酸含量Table 5 Content of 37 free amino acids in sample

续 表

由表5可知，鲍鱼蒸煮浓缩液中氨基酸种类丰富，但含量不高，其中牛磺酸含量较高，占比高达80%，其余如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸含量相对较高，故需要外加氨基酸进行美拉德反应，制备品质良好的海鲜风味基料。

2.3 单因素试验结果与分析

单因素试验结果见图2。

图2 单因素试验结果Fig.2 Single factor experimental results

由图2可知，以30 mL鲍鱼蒸煮浓缩液为反应基液进行美拉德反应，制备海鲜风味基料，通过单因素试验分别确定了葡萄糖、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、半胱氨酸的最佳添加量为6.0%、0.4%、2.5%、1.2%、0.12%，反应pH为7.5，反应时间为75 min，反应温度为110 ℃。在美拉德反应中单糖更易发生反应，其中葡萄糖更为廉价且反应性好，其与氨基酸反应比例的不同产生的色泽及风味产物也不同，反应基料较为稀释，还原糖量少则反应不彻底，量多可能会发生焦糖化反应而产生糊味，良好的添加量使得产生的风味更佳。在所有氨基酸中，赖氨酸参与反应能获得更深色泽且产生新鲜的面包味，而半胱氨酸反应产生的色泽则较浅且会产生强烈的肉香味，其余氨基酸反应产生的主要以焦糖味、果香味、花香味等为主，以混合氨基酸、多肽、水溶性蛋白质、还原糖等为反应基液，通过外加氨基酸与还原糖获得良好的反应比例，则可得到品质较佳、风味丰裕柔和的反应产物。

2.4 正交试验优化工艺条件

试验结果和数据处理见表6和表7。

表6 正交试验结果Table 6 Orthogonal experimental result

由表6可知，F0.05

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance

由表6和表7可知，4个因素中有1个因素对风味基料的综合评分具有显著的影响(P<0.05)，1个因素的影响特别显著(P<0.01)，对4个因素的极差R值进行分析为RA>RD>RC>RB，其影响程度主次顺序为：A(反应pH)>D(半胱氨酸添加量)>C(甘氨酸添加量)>B(精氨酸添加量)，以综合评分为依据的较优方案为A3B2C1D3即：反应pH 8.0、半胱氨酸添加量0.16%、甘氨酸添加量1.5%、精氨酸添加量0.4%。

2.5 风味成分分析

根据正交试验结果，对最优结果进行重复试验，得到的海鲜风味基料呈现液状、金黄色、气味浓郁、海鲜香味突出、无较明显腥味。并对制备出的海鲜风味基料采用顶空固相微萃取-气质联用的方法进行分析，得到总离子流色谱图，离子图谱中对应的化合物及相对百分含量见表8。

由表8可知，经过美拉德反应制备的海鲜风味基料共检测出挥发性物质60种，并由面积归一法求得各成分的相对百分含量，并列出匹配度大于75%的物质，发现挥发性成分中醇类10种(30.34%)、醛酮类8种(18.49%)、烃类10种(17.07%)、酯类9种(2.49%)、酸类10种(14.77%)、其他类13种(11.57%)，其中醇类、醛酮类、烃类、酸类及其他含氮、氧、硫的化合物含量，均达到10%以上，特别是醇类，达到了30%。

醇类化合物对于香气的形成具有重要作用，特别是对海鲜类风味基料，在人工调香及合成香料的过程中醇类发挥着重要作用，长链饱和醇虽然阈值较高但也具有清香和芳香味，如3-甲基-1-丁醇具有苦杏仁味，2，3-丁二醇气味微甜，不饱和醇的阈值相对较低，1-辛烯-3-醇、2-苯乙醇、2-呋喃甲醇、2-茨醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、4-甲基-5-噻唑乙醇等具有蘑菇香、泥土香、青草香、肉香等，对海鲜风味的形成具有重要作用，且含量也较高。醛类和酮类化合物都属于羰基化合物，其对肉香味成分的形成具有重要作用，其中检测到的醛类化合物有：苯甲醛(坚果香味)、戊醛(花生味)、癸醛(醛香、酯香)、壬醛(脂肪香)，酮类化合物有：环戊酮、十三烷酮、1-辛烯-3-酮、2-茨酮，具有甜的花香及果香风味，对海鲜风味的形成产生影响。烷烃类化合物广泛存在于海鲜等鱼类挥发性成分中，但其阈值较高，对海鲜风味的影响不大[11]。共检测出9种芳香类化合物，其阈值较低，可产生明显香气，其余如酸类化合物具有刺激性气味，对整体风味产生影响，呋喃、噻唑、吡嗪类等杂环类化合物是许多香味的中间体，具有浓郁的肉味、烤香味且阈值较低，不仅对海鲜风味的产生具有重要影响，对其他产品香气的形成也具有重要作用。

3 结论

以在鲍鱼加工中产生的鲍鱼蒸煮浓缩液为反应基料，并加入一定比例的葡萄糖、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、半胱氨酸等前体物质，在一定条件下进行美拉德反应可以得到具有一定品质的海鲜风味基料。

本文首先对鲍鱼蒸煮浓缩液中的多肽含量进行了测定，又对其中含有的氨基酸组成成分进行了分析，接着通过单因素试验及正交试验对影响海鲜风味基料品质的因素进行了研究，重点研究了各前体物质的添加量及反应条件的不同对海鲜风味基料的影响，其中有较大影响的4个因素的主次关系是：反应pH>半胱氨酸添加量>甘氨酸添加量>精氨酸添加量，1个因素具有显著影响，1个因素具有特别显著影响，从而确定正交试验的最优反应条件为：反应pH 8.0、精氨酸添加量0.4%、甘氨酸添加量1.5%、半胱氨酸添加量0.16%，其他试验条件为：葡萄糖6.0%、组氨酸1.2%、反应时间75 min、反应温度110 ℃，得到的海鲜风味基料品质较高，风味突出，最后对样品进行GC-MS分析检测，共发现挥发性风味物质60种，其中醇类10种、醛酮类8种、烃类10种、酯类9种、酸类10种、其他类13种。