宫雅雯 崔 彤 李圆龙 王树松,,3

1．河北师范大学化学与材料科学学院(石家庄, 050024)；2.河北医科大学研究生学院 ；3.河北省计划生育科学技术研究院/国家卫健委计划生育与优生重点实验室,河北省生殖医学重点实验室

精液由精子和精浆组成,其中精浆主要来自精囊、前列腺、睾丸和附睾以及尿道旁腺的分泌。精子和精浆中含有大量的酶,在男性生殖过程中起到不同的作用。精液中的酶主要由精子细胞、前列腺和附睾产生。因此,对精液中的酶进行检测可以评估精液质量,反映附属性腺功能状况,测定相关酶含量对男性不育症的诊疗有着重要的价值。现将与男性生殖相关酶的作用及其临床价值给予综述。

1 抗氧化酶

氧化应激(OS)被认为是男性不育症的主要原因之一,OS其特征是由活性氧(ROS)衍生的自由基引起的细胞损伤增加与抗氧化剂防御间的平衡。ROS通过单链和双链DNA断裂,交联和染色体重排引起破坏。当ROS大于抗氧化剂能力时,会导致潜在的细胞和DNA损伤。为了获得最佳的精子功能和受精,必须保持ROS与抗氧化剂的平衡。精液中抗氧化酶主要包括过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)。

SOD 是人体最重要的抗氧化酶,可以清除超氧阴离子并催化超氧化物转化为氧和过氧化氢,SOD可调控多种ROS的水平。在支持细胞、附睾和精浆中均发现了SOD存在,SOD在精子的发育和成熟过程中发挥作用。精浆SOD能够起到防止精子样本中磷脂和与磷脂结合的脂肪酸过氧化,保护精子免于脂质过氧化的伤害的作用[1],SOD还可以减少氧化核酸损伤,SOD1抗氧化剂基因的缺乏会导致小鼠睾丸修复DNA损伤的机制受损。与其他抗氧化剂相比,基于SOD的抗氧化剂能够更好的改善精子DNA完整性[2]。在对男性精浆的研究发现,精子密度与锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的活性呈正相关,前向运动与铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)的活性呈强正相关[3]。不育男性SOD活性明显低于可育男性,结果认为SOD可以作为评估精子质量和男性不育风险的有益指标[4]。

GPX应用谷胱甘肽作为电子供体催化过氧化氢和超氧阴离子。睾丸支持细胞中存在高浓度的GPX,附睾、输精管和精囊组织中存在GPX,GPX在附睾头部表达和分泌[5]。GPX在ROS的解毒中起着重要的作用,并被发现是在高水平ROS下首先被激活的酶。精子本身携带GPX,这些精子结合的GPX在精子发生的过程中结合在精子上,附睾中的GPX保护精子细胞和附睾组织免受过氧化损伤[6]。多项临床研究显示GPX与男性精液质量相关。患有少弱精子症精液中发现,GPX活性与形态正常精子百分率呈正相关；在精子病理组中,GPX活性均下降,是功能性精子参数异常的很好指标[7]。一项针对男性氧化应激的研究发现,不育男性精浆中GPX活性明显低于可育男性,精子DNA片段化与脂质过氧化呈正相关,DNA片段化的精子数量与精浆中GPX呈负相关[8]。精浆中GPX可用作男性生育状态的生物标记。

CAT是在过氧化物酶体中发现的一种酶,可将过氧化氢转换为水和氧,清除细胞中代谢产生的H2O2,进而保护细胞免受过氧化物的毒害。CAT能够减轻生殖细胞的氧化应激。研究显示,与野生型小鼠相比,衰老过表达CAT的小鼠没有表现出精子损失和睾丸生殖细胞的衰老相关损失,而氧化应激是衰老过程中精子累积损伤的主要因素[9]。研究发现不育男性和正常精子男性之间精浆中CAT含量存在差异,CAT活性与多项精液参数(体积,运动性,浓度和形态)呈正相关[10]。针对不育男性精子氧化应激的研究显示,与正常男性相比,不育男性精液的抗氧化酶活性明显较低[11]。

精浆中抗氧化酶活性对评估男性生殖能力很重要。精浆中活性氧水平和抗氧化剂含量之间的失衡会导致氧化应激,从而导致男性不育。多项临床研究证明,精浆中抗氧化酶的活性可以用作男性不育评估的生物标志物。

2 功能性酶

2.1 顶体功能酶

顶体反应是精子释放顶体酶,溶蚀放射冠和透明带的过程,是精卵结合的重要过程。

精子透明质酸酶(SPAM1)是糖基磷脂酰肌醇连接的精子膜蛋白,是催化透明质酸分解的酶,可以帮助精子穿透到达透明带,在睾丸和附睾中都有表达。在完整顶体的精子中,SPAM1位于整个头部的质膜和顶体内膜(IAM)上,在人的精子顶体反应过程中,在IAM以及从质膜和顶体外膜(OAM)融合而来的杂种囊泡上都观察到了SPAM1[12]。SPAM1在精子成熟中起重要作用,SPAM1能够松散地吸附在精子表面修饰精子质膜,SPAM1的摄取显著增加了对卵丘的渗透,因此摄取SPAM1是精子成熟的标志[13]。在男性生殖道中检测到SPAM1,生殖道中SPAM1可以在精子停留于生殖道时转移到精子表面。临床研究显示,与生育组相比,精液参数正常不育组和精液参数异常不育组的SPAM1活性均显著下降,提示在常规精液分析的基础上检测SPAM1活性可以反映精子功能,使原因不明的不育变得有因可查[14]。SPAM1在精子的顶体反应中发挥重要作用,SPAM1的缺失可能影响精子功能。

顶体酶(Acr)是一种丝氨酸蛋白酶,主要位于顶体基质中,前顶体蛋白是无酶活性的酶原,后被转变为Acr,Acr对于精子-透明带(ZP)渗透和精子-卵母细胞识别与结合发挥作用,被认为是哺乳动物受精过程中的关键酶之一。目前已从包括人类在内的各种物种的附睾和射精的精子中发现了前顶体蛋白和Acr,前顶体蛋白的亚细胞定位是前顶体(AA)的顶端部分和主要部分。动物实验显示,顶体酶基因被破坏的雄性大鼠的产仔数减少.体外受精结果显示,缺乏Acr精子穿透卵丘层的速度延迟[15]。临床研究显示,精子Acr活性与精子密度、活率、前向运动率和正常形态率呈正相关,精子Acr活性正常者的人工授精妊娠率显著高于异常者,精子Acr活性异常是不明原因性不育症的潜在病因,检测精子Acr活性对这些患者尤为必要[16]。对不孕夫妇助孕治疗方案的回顾分析显示,不明原因不孕夫妇男方精子Acr活性低时受精率也较低,因此建议男方精子Acr活性较低时不选择人工受精治疗,可选择卵细胞胞质内单精子注射治疗[17]。

2.2 其他功能性酶

乳酸脱氢酶C4(LDH-C4)是在生殖细胞中特异性表达的乳酸脱氢酶(LDH)独特同工酶,在精子中含量很高,LDH-C4的活性在青春期后的睾丸中才能检测到。在精子中存在多种与LDH-C4相关的蛋白质,这些蛋白质与腺苷三磷酸(ATP)的合成、利用、转运或螯合有关,为精子鞭毛的运动提供能量[18]。LDH-C基因的突变可导致LDH-C4的活性丧失,精子获能出现障碍,能够导致男性不育。临床研究显示,生育男性精子LDH-C4活性高于不育男性,在精子LDH活性缺乏的情况下可以直接选择卵胞浆内单精子注射(ICSI)[19]。研究表明,LDH-C4在精子ATP产生的过程中起着至关重要的作用,是男性生育和精子功能所必需的酶。

弹性蛋白酶(HNE)是一种丝氨酸蛋白酶,主要由多形核中性粒细胞(PMN)在炎症过程中释放,与活性氧结合,可帮助降解吞噬溶酶体内的被吞噬的微生物。但HNE的异常都可能对人体造成损害,HNE使蛋白水解细胞损伤和DNA断裂,这可能导致细胞死亡和组织破坏。泌尿生殖系统感染是男性不育的公认原因,PMN是精液中白细胞的主要种群,因此精浆中精浆弹性蛋白酶(PMNE)可以作为生殖道炎症的标记[20]。将PMN与精子共同孵育,发现中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的释放增加,精子的运动性减弱,表明这种相互作用会降低成功受精的可能性[21]。一项针对生殖道炎症的研究将PMNE的检测与白细胞精子的检测进行比较,发现在男性生殖道炎症和感染的诊断中,PMNE比白细胞精子症更敏感[22]。针对男性不育患者精子质量与PMNE的相关性研究显示,PMNE水平与精子浓度、精子活动率以及酸性磷酸酶、柠檬酸等生化指标具有密切相关联系[23]。精液PMNE的测定能诊断男性生殖道炎症, 也能提示女性输卵管损伤情况,输卵管堵塞可能影响体外受精结果,在人工授精前检测夫妇双方PMNE水平有利于提高人工受孕率[24]。PMNE是男性生殖道感染的重要指标,过高的PMNE对男性生殖能力具有不利的效果。

中性α-葡萄糖苷酶(NAG)来源于附睾,可以催化对糖蛋白或多糖中碳水化合物分解为葡萄糖,为精子代谢和运动提供能量,目前NAG是被广泛使用的附睾功能标志物。已证实男性精液中NAG活性与射精量、精子浓度、pH值和睾丸组织学密切相关[25]。梗阻性无精子症与少精子症中NAG异常发生率显著高于正常精子人群,表明检测精浆NAG对附属性腺病变引起的男性不育诊断具有一定的价值。且精浆NAG浓度与附睾梗阻的部位显著相关,根据精浆NAG浓度可以判断附睾梗阻的部位[26]。研究表明NAG活性是可靠的评估附睾功能的重要参数。

3 代谢性酶

酸性磷酸酶(ACP)可溶解多种磷酸单脂,将磷酸转移到葡萄糖或果糖上,与精子能量代谢有关,同时前列腺ACP还可通过磷酸化过程水解精囊分泌的Seminogelin蛋白促进精液液化。ACP是前列腺的特征分泌物,ACP含量是前列腺分泌功能的指标。精浆ACP水平降低可引起精浆锌及各种液化因子含量下降,使精子的活力和浓度降低,精浆ACP与PMNE呈现负相关,而PMNE是男性生殖道感染的指标,前列腺炎症越严重,PMNE水平越高,精液ACP含量对前列腺炎症的诊断有一定的价值[27]。关于不育患者精浆的研究显示,精子活力异常组和黏度增高组的精浆ACP含量明显低于活力和黏度正常组,而精子密度正常组的ACP高于密度降低组,精浆中ACP含量与精子质量密切相关,对于男性不育症的诊断具有意义。

肌酸激酶(CK)广泛分布在需要高能量的组织中,它催化肌酸与ATP的磷酸化(肌酸+ATP→磷酸肌酸+ ADP + H+),为需要大量能量的组织提供ATP缓冲系统。因此适当的CK活性对于精子功能至关重要,是精子正常代谢的必要关键酶。己酮可可碱(PF)通过增加精子的CK活性来增强精子的运动性,PF被认为是精子活力增强剂[28]。研究显示,铅、银、锡、汞、铟和铋等金属离子均可作为人精子肌酸激酶的竞争性抑制剂,可能通过抑制精子肌酸激酶而降低正常的精子代谢。吸烟会通过减少精子CK活性而潜在地损害精子能量稳态,并使精子活力受损,这种作用可能是导致男性不育的重要机制[29]。精浆CK水平与人类精液特征呈负相关,但精子活力≤5%的精液中CK活性显着增加,CK可能与精液中的低精子活力有关,因为精子质膜破裂并且酶被释放到精浆中[30]。CK是精子能量生成转移和利用的关键酶,CK的活性能够反映精子的质量。

综上所述,精液中的酶在抗氧化应激、精子发生获能、细胞代谢等方面发挥重要作用。对精液中酶的检测至关重要,精液中多种酶的活性可以有效反映精子质量,能够作为性腺是否存在感染的标志物,临床诊治男性不育的检测指标。目前,对于男性生殖系统相关酶的作用和影响机制还需要深入研究,期待精液中相关酶的研究在男性生殖的临床诊疗发挥更大的作用。