李 杰，杨育儒，王庆芬，郑绍忠，陈锦珊（中国人民解放军联勤保障部队第九〇九医院/厦门大学附属东南医院制剂科，福建 漳州 363000）

福建地处我国南方，夏季气温高、湿度大，驻地部队经常需要组织开展高强度的军事作业，极易发生中暑[1]。联勤保障部队第九〇九医院协定处方防暑清热饮由广藿香、白茅根、菊花、薄荷、枸杞等药材组成，具有芳香化湿、清热解毒、解渴生津之功效。现代药理研究表明，中药材菊花、薄荷、白茅根及中药复方制剂中的总黄酮和总多糖具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、生殖功能保护和改善等作用[2-6]，总黄酮和总多糖是防暑清热饮的主要活性成分，因此，对方中总黄酮和总多糖进行质量控制尤为重要[7-13]。

1 仪器与试剂

电子分析天平（AUX220，日本-岛津）；紫外-可见分光光度计（2550，岛津-苏州）；低速离心机（LD5-2A，北京医用离心机厂）；数显恒温水浴锅（HH2 江苏金坛市江南仪器厂）；华美冷柜（SY-176，杭州华美电冰箱厂）。芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100080-200707），无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110833-201205）。无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、浓硫酸、苯酚等试剂均为分析纯，水为纯化水。防暑清热饮（批号：20190107、20181212、20181210，规格：100 ml/瓶，第九〇九医院制剂科）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

2.1.1 芦丁对照品溶液

精确称取芦丁对照品14.8 mg，置于50 ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为296 μg/ml的芦丁对照品溶液。

2.1.2 葡萄糖对照品溶液

精密称取105 ℃下干燥至恒质量的无水葡萄糖对照品10.92 mg，置于100 ml量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为109.2 μg/ml的葡萄糖对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 总黄酮供试品溶液

精密量取防暑清热饮上清液10 ml，置100 ml烧杯中，搅拌下加95%乙醇，使含醇量达65%，冷藏5 h后取出，4 500 r/min离心10 min，倾取上清液，转移至50 ml量瓶中，加65%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 总多糖供试品溶液

取100 ml防暑清热饮，4 500 r/min离心10 min，再精密量取上清液1 ml，置100 ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 紫外检测波长的确定

取适中浓度芦丁、葡萄糖对照品溶液及供试品溶液，采用紫外-可见分光光度法在200～800 nm范围内进行全波长扫描。结果表明，芦丁与总黄酮的最大吸收波长均为508 nm，无水葡萄糖和总多糖最大吸收波长为487 nm，见图1。

2.4 测定方法

2.4.1 亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法

精密量取芦丁对照品溶液和供试品溶液各5.0 ml，分别置于25 ml量瓶中，加入65%乙醇6 ml，加入5%亚硝酸钠溶液1.0 ml，摇匀放置6 min后，加入10%硝酸铝溶液1.0 ml，摇匀放置6 min后，加入4%氢氧化钠溶液10.0 ml，再加水至刻度，摇匀放置15 min，以相应的试剂作为空白对照，于508 nm处测定其吸光度。

2.4.2 苯酚硫酸法

精密量取葡萄糖对照品溶液0.5 ml和供试品溶液1.0 ml，分别置于25ml具塞刻度试管中，分别加纯化水至2 ml，再各加50 mg/ml苯酚溶液1.0 ml、浓硫酸5.0 ml，摇匀，静置5 min，置沸水浴中显色15 min，冰水浴冷却至室温，以相应的试剂作为空白对照，于487 nm处测定其吸光度。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察

（1）总黄酮线性关系：精密量取“2.1.1”项下芦丁对照品溶液0、1、2、3、4、5 ml，分别置于25 ml量瓶中，按“2.4.1”项下方法制备系列浓度对照品溶液，以65%乙醇同法制备参比溶液，在508 nm波长处测定吸光度，以浓度（μg/ml）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。回归方程：A=0.011C-0.005，r=0.999 5。表明芦丁对照品浓度在0.00～59.20 μg/ml范围内吸光度呈良好线性关系。

（2）总多糖线性关系：精密量取“2.1.2”葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 ml，分别置于25 ml具塞刻度试管中，按照“2.4.2”项下自“分别加纯化水至2 ml，……，同法操作的相应溶剂为参比溶液”，在487 nm波长处测定吸光度。以浓度（μg/ml）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=0.009C，r=0.999 5，表明葡萄糖对照品浓度在10.92～109.20 μg/ml范围内吸光度呈良好线性关系。

2.5.2 精密度考察

精密量取浓度分别为296、54.6 μg/ml芦丁和葡萄糖对照品溶液，芦丁对照品溶液按总黄酮线性关系考察方法在508 nm波长处重复测定6次，计算得RSD为0.14%，无水葡萄糖对照品溶液显色后在487 nm波长处重复测定6次，计算得RSD为0.07%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性考察

分别精密量取防暑清热饮（批号：20190107）6份，按“2.2”项下方法制备总黄酮和总多糖供试品溶液，分别在508、487 nm波长处进行测定。结果总黄酮平均含量为0.825 mg/ml，RSD为0.59%，总多糖平均含量为4.434 mg/ml，RSD为2.0%，表明本方法重复性良好。

2.5.4 稳定性考察

（1）总黄酮稳定性：精密量取按“2.2.1”项下方法制备防暑清热饮（批号:20190107）5.0 ml，按“2.4.1”项下硝酸铝显色法，以65%乙醇同法制备参比溶液，分别于0、10、15、20、30、40 min在508 nm波长处测定吸光度，标准曲线法计算总黄酮含量平均值为0.814 mg/ml，RSD为1.82%（n=6），表明本方法在40 min内稳定。

（2）总多糖稳定性：精密量取按“2.2.2”项下方法制备防暑清热饮（批号:20190107）1.0 ml，按“2.4.2”项下苯酚硫酸显色法，以纯化水同法制备参比溶液，分别于0、10、20、30、40、60 min在487 nm波长处测定吸光度，标准曲线法计算总多糖含量平均值为4.488 mg/ml，RSD为0.5%（n=6），表明本方法在60 min内稳定。

2.5.5 加样回收率试验

（1）总黄酮加样回收试验：精密量取防暑清热饮上清液（批号：20190107）5.0 ml，按“2.2.1”项下制备供试品溶液。精密量取供试品溶液5 ml（82.5 μg/ml），置于25 ml量瓶中，共6份，分别加入芦丁对照品溶液（296 μg/ml）1.5 ml，按“2.4.1”项下硝酸铝显色法，以65%乙醇为参比液，在508 nm波长处测定吸收度，标准曲线法计算总黄酮含量，并计算得出回收率平均值为104.4%，RSD为1.11%（n=6），结果见表1。

（2）总多糖加样回收试验：精密量取防暑清热饮上清液（批号：20190107）0.5 ml，按“2.2.2” 项下制备供试品溶液。精密量取供试品溶液（22.17 μg/ml）1.0 ml，置于25 ml具塞比色管中，共6份，分别加入葡萄糖对照品溶液（109.2 μg/ml）0.2 ml，按“2.4.2”项下苯酚硫酸法，以纯化水为参比液，在487 nm波长处测定吸收度，用标准曲线法计算总黄酮含量，并计算得回收率平均值为104.8%，RSD为1.88%（n=6），结果见表1。

2.6 样品含量测定

取3个批号的防暑清热饮样品（批号：20181210、20181212、20190107），各3份，按“2.2”项下方法制备的防暑清热饮总黄酮和总多糖供试品溶液，并分别按照“2.4”项下方法操作，分别在508 nm和487 nm波长处进行测定，将所测得的吸光度值代入回归方程，计算总黄酮和总多糖含量。结果见表2。

表1 防暑清热饮总黄酮和总多糖加样回收率试验结果(n=6)

表2 防暑清热饮总黄酮和总多糖含量测定结果(n=3，μg/ml)

3 讨论

防暑清热饮为医院协定处方，可用于夏季作业及训练保障，方中总黄酮和总多糖协同发挥作用。通过测定方中总黄酮和总多糖的含量，更好地控制制剂质量，发挥保障作用。

防暑清热饮总黄酮供试品溶液前处理方法的确定：通过查阅文献及实验条件摸索，确定65%乙醇进行醇沉，冷藏5 h，4 500 r/min离心10 min。其中，若乙醇浓度过低会使总黄酮提取不完全，而乙醇浓度过高不易定容至准确浓度，冷藏时间考察了5、10、20 h，含量差别不大。另外，本实验对防暑清热饮本体液进行光谱扫描，在508 nm和487 nm处吸收峰很弱，基本无干扰，故采用溶剂空白为对照（图1）。

金属离子络合法是测定总黄酮含量最为常见的方法，其原理是在一定条件下，黄酮与金属离子发生络合反应，形成有颜色的络合物，通过比色法测定总黄酮含量，本实验通过对三氯化铝法和亚硝酸钠法考察，发现亚硝酸钠法显色测量的总黄酮结果较好。经过比较防暑清热饮经5、10、20倍稀释后在508 nm处测得吸光度值，5倍稀释后供试液的A508落在0.3～0.7之间，确定5倍为适宜的稀释倍数。稳定性试验发现在40 min内比较稳定，建议反应完成后尽快测定，避免测量误差。

苯酚硫酸法测总多糖是利用糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物。经过比较防暑清热饮稀释1、50、100倍后在487 nm处测得吸光度值，100倍稀释后供试液的A487落在0.3～0.7之间，100倍为适宜的稀释倍数。总多糖测定结果影响因素比较多，对测量用具的洁净度要求较高，每种试剂加入的方式对结果影响明显，因此，苯酚应临用现配，向样品中加入苯酚溶液需要迅速摇匀，在硫酸沿壁流下加完立即摇匀。

本实验建立的总黄酮和总多糖供试品溶液制备方法简便、快速、准确、灵敏，可作为防暑清热饮质控方法，因不同批次中药材质量差异较大，后续需要经过多批次测定以确定质控标准。